글루타티온 S-트랜스퍼라제, GSTs는 세포내 전기성 화합물을 저하시키고 세포사멸 경로에 관여하는 MAP 키나아제와 상호 작용하는 대사 효소입니다. GST의 발현의 이 두 가지 역할 때문에 약물 내성과 상관관계가 있기 때문에, 이 문제를 중화하는 해결책은 효소 억제제사용이다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 그 같은 분자를 시험하는 쪽을 제공합니다.
이 방법은 효소 화합물의 상호 작용을 검사하기 위한 빠르고 쉬운 방법을 활용하고자 하는 GST 억제제 분야에 새로운 모든 사람을 대상으로 합니다. 또한 억제제의 2가지 특성, 억제 농도(50, IC50) 및 억제의 상수를 결정하는 단계를 제공하며, Ki.As 우리는 억제 모드를 정의하는 기술을 잘 설명했으며, 이는 생물학적 상이한 결과를 가지는 중요한 특징이다. 첫 번째 단계는 단위당 솔루션에서 GST의 효소 활성을 결정하는 것입니다.
밀 당 하나의 단위는 분당 제품의 하나의 마이크로 몰라를 합성하는 데 필요한 효소의 양입니다. 효소 용액의 단백질 농도를 정량화합니다. 당신의 편의에 따라 기술을 선택합니다.
단백질 용액을 물 에서 밀 당 0.02 밀리그램의 최종 농도로 희석하십시오. 얼음에 효소 솔루션을 유지합니다. 96웰 플레이트에서 반응을 준비합니다.
빈 우물에 20 마이크로리터의 물을 추가합니다. 테스트 웰에 효소 솔루션의 20 마이크로리터를 추가합니다. GSH 의 마이크로 리터 20를 추가합니다.
PBS 의 150 마이크로 리터를 추가합니다. CDNB 10마이크로리터를 50밀리몰러에 추가합니다. 접시를 셰이커에 몇 초 동안 섞습니다.
분광판 판독기를 사용하면 분당 340 나노미터에서 10분 동안 흡광도를 기록합니다. 스프레드시트와 특수 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석합니다. 입수한 결과에 따르면, 수중 밀당 0.1단위로 GST 스톡 솔루션을 준비한다.
200 마이크로리터의 최종 부피에서 95%에탄올에서 CDNB의 6가지 농도를 20회 준비합니다. 모든 우물에 25 밀리머에 GSH의 20 마이크로 리터를 추가합니다. 테스트 웰에, 밀 당 0.1 단위에 GST의 20 마이크로 리터를 추가합니다.
빈 우물에 20 마이크로리터의 물을 넣습니다. 모든 우물에 150 마이크로리터의 PBS를 추가하십시오. 테스트 웰과 빈 우물에 해당 CDNB 솔루션의 마이크로리터 10기를 추가합니다.
CDNB의 모든 농도는 특정 공백이 필요합니다. 쉐이커에 있는 함량을 몇 초 간 섞어 분당 340 나노미터에서 10분 동안 흡광도를 기록합니다. 특수 소프트웨어로 결과를 분석합니다.
마이클리스-멘텐 플롯을 그려 Km을 결정합니다. 결과에 따르면, 95%에탄올에서 획득한 Km의 20배에 달하는 CDNB 솔루션을 준비한다. 억제제 용액을 필요한 농도로 희석시다.
96웰 플레이트에서 잠재적인 GST 억제제의 마이크로리터 2개를 추가합니다. 빈 우물에 희석제의 마이크로리터 2개를 추가합니다. 25 밀리머에 20 마이크로리터를 모든 웰과 168 마이크로리터의 PBS에 추가합니다.
이전 단계에서 발견된 CDNB 20배의 마이크로리터 10기를 추가합니다. 접시를 셰이커에 몇 초 동안 섞습니다. 10분 동안 매분 340 나노미터로 흡광도를 기록합니다.
특수 소프트웨어로 결과를 분석합니다. 결과에 따르면, 동일한 블랭크는 각 GST 억제제에 대해 사용하거나 조정되어야 합니다. 시험된 GST 억제제의 9개의 농도를 준비합니다.
PBS 의 148 마이크로리터와 25 나노 몰러에서 20 마이크로 리터로 구성된 에세이 솔루션을 하나의 반응에 대해 준비하십시오. 용액을 잘 섞으세요. 시험 우물의 경우, GST 억제제 2개, GST 20마이크로리터, 밀당 0.1단위, 분석 용액의 168마이크로리터를 추가한다.
대조유의 경우 GST 억제제에 사용되는 희석제 2개, mil당 GST 0.1 단위의 마이크로리터 20개, 분석 용액의 168마이크로리터를 추가합니다. 빈 우물의 경우 GST 억제제에 사용되는 희석제 2개, 소리터 20개, 분석 용액의 168마이크로리터를 추가합니다. 공백을 포함하여 각 웰에 대해 CDNB 솔루션 10마이크로리터를 추가합니다.
쉐이커에 몇 초 동안 섞습니다. 10분 동안 매분 340 나노미터로 흡광도를 기록합니다. 특수 소프트웨어로 IC50을 계산합니다.
프로토콜에 설명된 대로 4개의 CDNB 솔루션을 서로 다른 농도로 준비합니다. 또한 프로토콜에 설명된 바와 같이, 다른 농도에서 세 개의 GST 억제제 솔루션을 준비합니다. PBS 의 148 마이크로리터와 20 개의 GSH 마이크로 리터를 포함하는 효소 솔루션을 하나의 반응에 대해 25 밀리머로 준비하십시오.
제어 우물의 경우 GST 억제제에 사용되는 희석제의 마이크로리터 2개를 추가합니다. 그리고 테스트 및 빈 우물에 대 한, 올바른 GST 억제제 솔루션의 두 마이크로 리터. 몇 초 동안 섞는다.
효소 용액의 168 마이크로리터를 각 웰에 추가합니다. 각각의 양분에 해당 CDNB 농도의 10 마이크로리터를 추가합니다. 몇 초 동안 섞은 다음 10 분 동안 분당 340 나노미터로 흡광도를 기록합니다.
GST 억제제의 세 가지 상이한 농도를 따라 CDNB의 4개의 상이한 농도를 사용하기 위해 동일한 도금 패턴을 사용하여 실험을 반복한다. 특수 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석하여 억제 모드를 결정하고 Ki.이 프로토콜은 항암 특성을 가진 분자인 커큐민에 적용되었다. 이 화합물은 여러 GST 동위 체형에 대한 결합 선호도의 계산 예측에 의해 선택되었다.
동시에, 동일한 실험은 실험실 환경에서 가장 널리 사용되는 GST 억제제인 에타크라이닉산에 대해 양성 대조군으로서 수행되었다. 억제 효능은 말 간에서 GSTs의 풀에서 테스트 하 고 선택의 어떤 GST 등색에 적용할 수 있습니다. IC(50)는 억제의 유형뿐만 아니라 기체를 결정되었다.
최고의 분석 조건을 제공하기 위해 먼저, 마이클리스-멘텐 상수, GST의 풀이 있는 기판 CDNB의 Km이 결정되었다. Km은 기판과 효소 사이의 친화성을 대표합니다. 이 가치의 결정은 에세이에 비포화 농도를 사용하기 위해 중요합니다.
사실, 두 개의 높은 농도 경쟁 억제제 불이익을 수 있습니다., 반면 너무 적은 금액을 감지 할 수 없습니다. 이에 대한 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오. 이 실험을 위해, CDNB의 6개의 다른 농도는 GSH와 GST 효소의 고정된 농도로 이용되었다.
Michaelis-Menten 그래프는 X 축에 밀리머로 기판 농도를 플롯하고 Y축에서 분당 밀리머로 속도를 플로팅하여 얻어졌습니다. 반응의 속도는 방정식 으로 계산되었다. Km은 공주 형성의 고원을 얻기 위해 기판으로 용액의 포화 후 얻은 값인 반 Vmax로 결정된다.
테스트된 GST 효소 솔루션에 대한 CDNB의 Km은 전문 소프트웨어의 계산에 따라 0.26 밀리머로 결정되었습니다. IC50은 효소 활성을 반으로 억제하는 데 필요한 물질의 농도로 정의된다. IC50은 GST 억제제의 로그리징 농도가 X축및 Y축상GST 활동의 백분율에 플롯된 비선형 회귀 그래프를 사용하여 추정되었다.
억제제의 9개의 다른 농도가 사용되었다. GST 활동은 방정식 1의 적용으로 결정되었습니다. 결과는 억제제 없이 대조군을 이용하여 정규화되었다.
커큐민은 물에 용해되지 않습니다. 따라서 더 높은 농도는 사용할 수 없었다, 어렵게 최대 억제를 얻을 수 있도록. 그럼에도 불구하고 전문 소프트웨어는 이 GST 풀에 대한 IC50 커리큘럼을 31.4 마이크로몰라값으로 예측할 수 있었습니다.
병렬로, 동일한 실험은 양성 대조군으로서 에타크라이닉산을 통해 수행되었다. 예상대로, 이 분자는 6.7 마이크로몰러의 IC50을 가진 GST 억제제로 확인되었습니다. 이러한 결과는 커큐민이 에타크라이닉산과 유사한 마이크로몰라 범위에서 IC50을 가진 GST 억제제임을 확인했습니다.
GST 억제제로서 커큐민을 자세히 연구하기 위해 억제의 유형뿐만 아니라 억제의 일정, Ki, 결정되었다. 첫째, 억제의 모형은 Michaelis-Menten 그래프로 평가되었습니다. GST 억제제의 농도를 증가시키면서 기판 CDNB의 다른 농도를 사용함으로써, Kms는 커큐민 농도와의 상관 관계가 크게 증가하는 반면 Vmax는 다양한 조건에도 불구하고 변하지 않았습니다.
억제의이 모드는 억제의 경쟁 모드의 전형이다. 다른 유형의 억제에 대한 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오. 기는 동일한 데이터 집합을 사용하여 억제의 유형에 따라 그에 따라 계산되었으며, 커큐민의 23.3 마이크로몰라값을 제공한다.
설명된 방법은 정확하고 재현 가능한 결과를 제공하기 위해 특정 단계를 통해 주의해야 하는 기본적인 효소 에세이입니다. 효소에 기판의 친화성을 묘사하는 Michaelis-Menten 상수 Km의 결정은 중요한 단계 중 하나입니다. 사실, 기판 농도가 너무 높거나 너무 낮을 때, 올바른 억제 모드를 식별하기 어렵게 하고 Ki는 올바르게 계산되지 않는다.
이 절차는 예를 들어 GSTA1 및 P1 중 하나인 인간 재조합 GST에 적용될 수 있으며, 약물 내성을 감소시키기 위해 전기성 제제와 함께 사용될 가능성을 평가하기 위해 세포 배양 연구에서 사용된다.
