细胞性谷胱甘肽S-转移酶潜在抑制剂的分光光度筛选

谷胱甘肽S-转移酶，GSTs，是代谢酶，降解细胞内电亲化合物，并与参与凋亡途径的 MAP 激酶相互作用。由于GST的这两种表达作用与耐药性相关，因此解决这个问题的解决方法是使用酶抑制剂。通过该协议，我们提供了一种测试此类分子的方法。

这种方法面向所有新到GST抑制剂领域的新分子，他们希望利用一种快速、简单的方法来检查酶化合物的相互作用。我们还提供了确定抑制剂的两个特征的步骤，即抑制剂浓度50、IC50和抑制常数Ki.As我们很好地描述了定义抑制模式的技术，这是具有不同生物后果的一个重要特征。第一步是确定每单位溶液中 GST 的酶活性。

每密耳一个单位是每分钟合成一微摩尔产品所需的酶量。量化酶溶液的蛋白质浓度。根据您的便利性选择技术。

将蛋白质溶液稀释至水中每千分之一千克的最终浓度。将酶溶液放在冰上。在 96 井板中准备反应。

为空白井添加20微升水。为测试井添加 20 微升的酶溶液。添加 20 微升 GSH。

添加 150 微升 PBS。在每井中加入 10 微升 CDNB，每井 50 毫摩尔。将盘子在摇床上混合几秒钟。

使用分光光度计板读取器，每分钟以 340 纳米记录吸收度 10 分钟。使用电子表格和专业软件分析结果。根据获得的结果，以每千里耳的0.1单位的水准备GST库存溶液。

在 200 微升的最终体积中，在 95%乙醇中准备 6 种不同浓度的 CDNB 20 次。进入每口井，在25毫摩尔添加20微升GSH。在测试井中，以每密耳 0.1 单位的速度添加 20 微升的 GST。

在空白井上，加入20微升水。进入每一个井，添加150微升的PBS。在测试井和空井上，加入10微升的相应CDNB溶液。

CDNB 的每个浓度都需要一个特定的空白。将内容混合在摇床上几秒钟，将吸收度记录为每分钟 340 纳米，10 分钟。使用专用软件分析结果。

通过绘制迈克尔斯-门滕绘图来确定公里。根据结果，在95%乙醇中，以20倍于获得的Km来准备CDNB溶液。将抑制剂溶液稀释到所需的浓度。

在96井的板中，添加两个微升的潜在GST抑制剂。在空白井上，添加两个稀释剂的微升。在每口25毫摩尔和168微升PBS中加入20微升GSH。

添加上一步中发现的 10 微升 CDNB 20 倍公里。将盘子在摇床上混合几秒钟。将吸收量记录在每分钟 340 纳米，10 分钟。

使用专用软件分析结果。根据结果，相同的空白可用于每个GST抑制剂或必须调整。准备九浓度的测试GST抑制剂。

准备由 148 微升 PBS 和 20 微升 GSH 在 25 纳米摩尔为一次反应的散文解决方案。很好地混合解决方案。对于测试井，添加两个GST抑制剂微升、20微升GST、0.1单位每密耳和168微升的检测溶液。

对于控制井，添加用于 GST 抑制剂的稀释剂的两微升、每密耳 GST 0.1 单位的 20 微升和 168 微升的测定溶液。对于空白井，添加用于 GST 抑制剂的稀释剂的两微升、20 微升水和 168 微升的测定溶液。为每一井添加 10 微升 CDNB 解决方案，包括空白。

在摇床上混合几秒钟。将吸收量记录在每分钟 340 纳米，10 分钟。使用专用软件计算 IC50。

准备四种不同浓度的 CDNB 解决方案，如协议所述。准备三种不同浓度的GST抑制剂溶液，如协议所述。准备含有148微升PBS和20微升GSH的酶溶液，在25毫摩尔进行一次反应。

对于控制井，添加用于 GST 抑制剂的稀释剂的两微升。而对于试验和空白井，两个微升的正确GST抑制剂溶液。混合几秒钟。

在每个井中加入168微升的酶溶液。在每个井中加入10微升相应的CDNB浓度。混合几秒钟，然后记录每分钟340纳米的吸收度10分钟。

使用相同的电镀模式重复实验，以便沿 GST 抑制剂的三种不同浓度使用 CDNB 的四种不同浓度。使用专门的软件分析结果，以确定抑制模式，以及Ki.此协议应用于姜黄素，一种具有抗癌特性的分子。此化合物由多个 GST 等构体绑定相关性的计算预测选择。

同时，对电子丙烯酸进行了同样的实验，乙酸是实验室环境中使用最广泛的GST抑制剂，作为阳性对照剂。抑制效力在马肝的GST池上进行了测试，可应用于任何GST等同形式的选择。IC 50以及抑制类型和淇被确定。

为了提供最佳的测定条件，首先，Michaelis-Menten 常数，确定基板 CDNB 的公里与 GST 池。Km 代表基质和酶之间的亲和力。确定这个值对于本文使用非饱和浓度至关重要。

事实上，两种高浓度可能不利于竞争抑制剂，而太少的浓度是无法检测到的。有关此更多详细信息，请参阅文本。在本次实验中，使用六种不同浓度的CDNB，其浓度为GSH和GST酶。

Michaelis-Menten 图是通过绘制 X 轴上的基板浓度（以毫摩尔为单位）和 Y 轴上以分钟毫摩尔为单位的速度获得的。用方程一计算了反应速度。Km 被确定为半 Vmax，这是溶液与基材饱和后获得的值，以便获得偶联形成高原。

测试的 GST 酶解决方案的 CDNB Km 根据专用软件的计算确定为 0.26 毫摩尔。IC50 被定义为抑制酶活性所需的物质浓度减半。使用非线性回归图估算 IC50，其中在 X 轴上绘制了 GST 抑制剂的对数浓度和 Y 轴上的 GST 活性百分比。

使用了九种不同浓度的抑制剂。GST 活动是使用等式 1 确定的。使用无抑制剂的对照方法对结果进行规范化。

姜黄素在水中不溶性。因此，不可能使用较高的浓度，因此难以获得最大的抑制。然而，一个专门软件能够预测这一消费税库的IC50课程值为31.4微摩尔。

同时，对乙酸进行同样的实验，作为阳性对照。不出所料，该分子被确认为具有6.7微摩尔IC50的GST抑制剂。这些结果证实，姜黄素也是一种GST抑制剂，在微摩尔范围内含有IC50，类似于乙酸。

为了更详细地研究姜黄素作为GST抑制剂，确定了抑制的类型，以及抑制的常数，淇，确定。首先，使用Michaelis-Menten图评估抑制的类型。通过使用不同浓度的基质 CDNB，同时增加 GST 抑制剂的浓度，Kms 与姜黄素浓度的相关性显著增加，而 Vmax 保持不变，尽管条件不同。

这种抑制模式是典型的竞争抑制模式。有关其他类型的抑制的更多详细信息，请参阅文本。根据使用同一数据集的抑制类型相应地计算 Ki，提供 23.3 微摩尔姜黄素的值。

解释方法是基本的酶散文，需要通过一定步骤的细心，以提供正确和可重复的结果。确定Michaelis-Menten常数Km，该公里，即描述基质与酶的亲和力，是关键步骤之一。事实上，当基板浓度过高或过低时，很难识别正确的抑制模式，并且淇没有正确计算。

此过程可应用于人体重组 GST，例如 GSTA1 和 P1 之一，用于细胞培养研究，以评估与嗜电剂结合使用以降低耐药性的潜力。