Glutathion S-transferases, GSTs, sont des enzymes métaboliques qui dégradent les composés électrophiliques intracellulaires et interagissent avec les kinases MAP impliqués dans la voie de l’apoptose. En raison de ces deux rôles d’expression de la TPS est corrélé avec la résistance aux médicaments, une solution pour contrer ce problème est d’utiliser des inhibiteurs enzymatiques. Avec ce protocole, nous fournissons un moyen de tester de telles molécules.
Cette méthode s’adresse à tous ceux qui sont nouveaux dans le domaine des inhibiteurs de la TPS, qui souhaitent utiliser une méthode rapide et facile pour examiner l’interaction entre les enzymes et les composés. Nous fournissons également les étapes pour déterminer deux caractéristiques d’un inhibiteur, la concentration inhibitrice 50, IC50, et la constante de l’inhibition, Ki.As bien nous avons décrit la technique pour définir le mode d’inhibition, une caractéristique importante qui Ki.As des conséquences biologiques différentes. La première étape consiste à déterminer l’activité enzymatique de la TPS en solution par unité.
Une unité par mil est le volume d’enzyme nécessaire pour synthétiser un micromolaire de produit par minute. Quantifier la concentration en protéines de la solution enzymatique. Choisissez la technique en fonction de votre commodité.
Diluer la solution protéique à une concentration finale de 0,02 milligramme par mil dans l’eau. Gardez la solution enzymatique sur la glace. Préparer la réaction dans une assiette de 96 puits.
Ajouter 20 microlitres d’eau pour les puits vierges. Ajouter 20 microlitres de la solution enzymatique pour les puits d’essai. Ajouter 20 microlitres de GSH.
Ajouter 150 microlitres de PBS. Ajouter 10 microlitres de CDNB à 50 millimolaires dans chaque puits. Mélanger la plaque sur un shaker pendant quelques secondes.
Avec un lecteur de plaques spectrophotométriques, enregistrez l’absorption à 340 nanomètres par minute pendant 10 minutes. Analyser les résultats dans une feuille de calcul et avec un logiciel spécialisé. Selon les résultats obtenus, préparer une solution de stock de TPS à 0,1 unité par mil dans l’eau.
Préparer six concentrations différentes de CDNB 20 fois dans 95% d’éthanol dans un volume final de 200 microlitres. Dans chaque puits, ajouter 20 microlitres de GSH à 25 millimolar. Aux puits d’essai, ajouter 20 microlitres de la TPS à 0,1 unité par mil.
Aux puits vierges, ajouter 20 microlitres d’eau. Dans chaque puits, ajouter 150 microlitres de PBS. Aux puits d’essai et aux puits vierges, ajouter 10 microlitres de la solution CDNB correspondante.
Chaque concentration de CDNB a besoin d’un blanc spécifique. Mélanger le contenu sur un shaker pendant quelques secondes, enregistrer l’absorption à 340 nanomètres par minute pendant 10 minutes. Analyser les résultats à l’aide d’un logiciel spécialisé.
Déterminez le Km en dessinant une intrigue de Michaelis-Menten. Selon les résultats, préparer une solution CDNB à 20 fois le km obtenu dans 95% d’éthanol. Diluer la solution inhibiteur à la concentration requise.
Dans une plaque de 96 puits, ajouter deux microlitres de l’inhibiteur potentiel de la TPS. Aux puits vierges, ajouter deux microlitres du diluant. Ajouter 20 microlitres de GSH à 25 millimolaires dans chaque puits et 168 microlitres de PBS.
Ajouter 10 microlitres de CDNB 20 fois km trouvés lors de l’étape précédente. Mélanger la plaque sur un shaker pendant quelques secondes. Enregistrez l’absorption à 340 nanomètres par minute pendant 10 minutes.
Analyser les résultats à l’aide d’un logiciel spécialisé. Selon les résultats, le même blanc peut être utilisé pour chaque inhibiteur de la TPS ou doit être ajusté. Préparer neuf concentrations de l’inhibiteur testé de la TPS.
Préparez la solution d’essai composée de 148 microlitres de PBS et de 20 microlitres de GSH à 25 nanomolaires pour une réaction. Bien mélanger de la solution. Pour les puits d’essai, ajouter deux microlitres d’inhibiteur de la TPS, 20 microlitres de TPS, 0,1 unité par mil et 168 microlitres de la solution d’analyse.
Pour les puits de contrôle, ajouter deux microlitres du diluant utilisé pour l’inhibiteur de la TPS, 20 microlitres de TPS 0,1 unité par mil et 168 microlitres de la solution d’analyse. Pour les puits vierges, ajouter deux microlitres du diluant utilisé pour l’inhibiteur de la TPS, 20 microlitres d’eau et 168 microlitres de la solution d’analyse. Ajouter 10 microlitres de la solution CDNB pour chaque puits, y compris le blanc.
Mélanger sur le shaker pendant quelques secondes. Enregistrez l’absorption à 340 nanomètres par minute pendant 10 minutes. Calculez l’IC50 à l’aide d’un logiciel spécialisé.
Préparez quatre solutions CDNB à différentes concentrations, comme l’explique le protocole. Préparer trois solutions d’inhibiteur de la TPS à différentes concentrations, comme l’explique le protocole. Préparez les solutions enzymatiques contenant 148 microlitres de PBS et 20 microlitres de GSH à 25 millimolaires pour une réaction.
Pour les puits de contrôle, ajouter deux microlitres du diluant utilisé pour l’inhibiteur de la TPS. Et pour le test et les puits vierges, deux microlitres de la solution d’inhibiteur de la TPS correcte. Mélanger pendant quelques secondes.
Ajouter 168 microlitres de la solution enzymatique à chaque puits. Ajouter 10 microlitres des concentrations correspondantes de CDNB dans chaque puits respectif. Mélanger pendant quelques secondes, puis enregistrer l’absorption à 340 nanomètres par minute pendant 10 minutes.
Répétez l’expérience en utilisant le même modèle de placage afin d’utiliser les quatre concentrations différentes de CDNB le long des trois concentrations différentes d’inhibiteur de la TPS. Analyser les résultats avec un logiciel spécialisé pour déterminer le mode d’inhibition, ainsi que le protocole Ki.This a été appliqué à la curcumine, une molécule aux propriétés anticancéreuses. Ce composé a été choisi par des prédictions computationnelles de l’affinité contraignante pour plusieurs isoformes de TPS.
Parallèlement, les mêmes expériences ont été menées sur l’acide éthacrynique, l’inhibiteur de la TPS le plus largement utilisé dans l’environnement de laboratoire comme un contrôle positif. La puissance inhibitrice a été testée sur un pool de TSL provenant du foie équin et peut être appliquée à toutes les isoformes de la TPS de choix. L’IC 50 ainsi que le type d’inhibition et le Ki ont été déterminés.
Afin de fournir les meilleures conditions d’analyse, tout d’abord, Michaelis-Menten constante, Km du substrat CDNB avec un pool de GSTs a été déterminée. Km est représentatif de l’affinité entre le substrat et l’enzyme. La détermination de cette valeur est cruciale afin d’utiliser une concentration non saturante pour l’essai.
En fait, deux concentrations élevées pourraient désavantager les inhibiteurs concurrentiels, alors que trop peu de quantité ne sera pas détectable. S’il vous plaît voir les textes pour plus de détails à ce sujet. Pour cette expérience, six concentrations différentes de CDNB ont été utilisées avec une concentration fixe d’enzymes GSH et GST.
Le graphique De Michaelis-Menten a été obtenu en traçant les concentrations de substrat en millimolaire sur l’axe X et la vitesse en millimolaire par minutes sur l’axe Y. La vitesse de la réaction a été calculée avec l’équation 1. Km est déterminé comme moitié Vmax, une valeur obtenue après saturation de la solution avec le substrat afin d’obtenir un plateau de formation conjuguée.
Le km de CDNB pour la solution enzymatique de TPS testée a été déterminé comme étant de 0,26 millimolaire selon les calculs d’un logiciel spécialisé. IC50 est défini comme la concentration de substance nécessaire pour inhiber l’activité enzymatique de moitié. L’IC50 a été estimé à l’aide d’un graphique de régression non linéaire où la concentration logarithmique de l’inhibiteur de la TPS a été tracée sur l’axe X et le pourcentage d’activité de TPS sur l’axe Y.
Neuf concentrations différentes d’inhibiteur ont été utilisées. L’activité de TPS a été déterminée par application de l’équation 1. Les résultats ont été normalisés en utilisant le contrôle sans inhibiteur.
La curcumine est mal soluble dans l’eau. Ainsi, des concentrations plus élevées n’ont pas été possibles à utiliser, ce qui rend difficile l’obtention d’une inhibition maximale. Néanmoins, un logiciel spécialisé a été en mesure de prédire l’IC50 du programme d’études pour ce bassin de TPS à une valeur de 31,4 micromolaires.
En parallèle, la même expérience a été menée avec de l’acide éthacrynique comme un contrôle positif. Comme prévu, cette molécule a été confirmée comme inhibiteur de la TPS avec un IC50 de 6,7 micromolaires. Ces résultats ont confirmé que la curcumine est aussi un inhibiteur de la TPS avec un IC50 dans la gamme des micromolaires, semblable à l’acide éthacrynique.
Pour étudier plus en détail la curcumine comme inhibiteur de la TPS, le type d’inhibition, ainsi que la constante de l’inhibition, Ki, ont été déterminés. Tout d’abord, le type d’inhibition a été évalué avec les graphiques de Michaelis-Menten. En utilisant différentes concentrations du substrat CDNB tout en incrémentant les concentrations de l’inhibiteur de la TPS, kms considérablement augmenté en corrélation avec les concentrations de curcumine tandis que Vmax est resté inchangé malgré les conditions variables.
Ce mode d’inhibition est typique d’un mode compétitif d’inhibition. Pour plus de détails sur les autres types d’inhibitions, veuillez consulter le texte. Ki a été calculé en conséquence en fonction du type d’inhibition à l’aide du même ensemble de données, fournissant une valeur de 23,3 micromolaires de curcumine.
Les méthodes expliquées sont des essais enzymatiques de base, qui nécessitent une prudence à travers certaines étapes afin de fournir des résultats corrects et reproductibles. La détermination du km constant de Michaelis-Menten, qui délimite l’affinité du substrat avec l’enzyme est l’une des étapes cruciales. En fait, lorsque la concentration du substrat est trop élevée ou trop faible, il est difficile d’identifier le bon mode d’inhibition et ki n’est pas correctement calculé.
Cette procédure peut être appliquée aux TSL recombinants humains, par exemple GSTA1 et un de P1, sont utilisés dans des études de culture cellulaire pour évaluer le potentiel à utiliser en combinaison avec des agents électrophiliques pour réduire la résistance aux médicaments.
