Glutatyon S-transferazları, GST'ler, hücre içi elektrofilik bileşikleri bozan ve apoptoz iskende yer alan MAP kinazlarla etkileşime giren metabolik enzimlerdir. GST ifade bu iki rol ilaç direnci ile ilişkili olduğu için, bu sorunu karşı koymak için bir çözüm enzimatik inhibitörleri kullanmaktır. Bu protokolle, bu tür molekülleri test etmenin bir yolunu sağlıyoruz.
Bu yöntem, enzim-bileşiğin etkileşimini incelemek için hızlı ve kolay bir yöntem kullanmak isteyen GST inhibitörleri alanında yeni olan herkese yöneliktir. Ayrıca bir inhibitörün iki özelliğini, inhibitör konsantrasyonu 50, IC50'yi ve inhibisyon sabitini belirlemek için gerekli adımları Ki.As, farklı biyolojik sonuçları olan önemli bir özellik olan inhibisyon modunu tanımlama tekniğini iyi tanımladık. İlk adım birim başına çözüm GST enzimatik aktivitesini belirlemektir.
Mil başına bir birim dakikada bir mikromolar ürün sentezlemek için gerekli enzim hacmidir. Enzim çözeltisinin protein konsantrasyonuna göre ölçün. Kolaylığınıza göre tekniği seçin.
Protein çözeltisini, sudaki mil başına 0,02 miligramlık son konsantrasyona seyreltin. Enzimatik çözeltiyi buzda tutun. Reaksiyonu 96 kuyulu bir plakayla hazırlayın.
Boş kuyular için 20 mikrolitre su ekleyin. Test kuyuları için enzimatik çözeltinin 20 mikrolitresini ekleyin. 20 mikrolitre GSH ekleyin.
PBS 150 mikrolitre ekleyin. Her kuyuya 50 milimolar cdnb 10 mikrolitre ekleyin. Plakayı bir çalkalayıcının üzerine birkaç saniye karıştırın.
Spektrofotometrik plaka okuyucu ile emiciliği dakikada 340 nanometre ile 10 dakika boyunca kaydedin. Sonuçları elektronik tabloda ve özel bir yazılımla analiz edin. Elde edilen sonuçlara göre, su mil başına 0,1 birim bir GST stok çözeltisi hazırlayın.
200 mikrolitrelik son hacimde %95 etanolde 20 kez altı farklı CDNB konsantrasyonu hazırlayın. Her kuyuya 25 milimolar'da 20 mikrolitre GSH ekleyin. Test kuyularına, mil başına 0,1 birim gst 20 mikrolitre ekleyin.
Boş kuyulara 20 mikrolitre su ekleyin. Her kuyuya 150 mikrolitre PBS ekleyin. Test kuyuları ve boş kuyular için, ilgili CDNB çözeltisinin 10 mikrolitreekleyin.
CDNB'nin her konsantrasyonunun belirli bir boşa ihtiyacı vardır. Birkaç saniye için bir shaker üzerinde içerik karıştırın, 10 dakika boyunca her dakika 340 nanometre de emici kayıt. Sonuçları özel bir yazılımla analiz edin.
Bir Michaelis-Menten arsa çizerek Km belirleyin. Sonuçlara göre, %95 etanolde elde edilen Km'nin 20 katı cdnb çözeltisi hazırlayın. Inhibitör çözeltiyi gerekli konsantrasyona seyreltin.
96-iyi plaka, potansiyel GST inhibitörü iki mikrolitre ekleyin. Boş kuyulara iki mikrolitre dilüent ekleyin. Her kuyuya 25 milimolar'da 20 mikrolitre GSH ve 168 mikrolitre PBS ekleyin.
CdNB 10 mikrolitre ekleyin 20 kez Km önceki adımda bulundu. Plakayı bir çalkalayıcının üzerine birkaç saniye karıştırın. Emiciliği dakikada 340 nanometre de 10 dakika boyunca kaydedin.
Sonuçları özel bir yazılımla analiz edin. Sonuçlara göre, aynı boş her GST inhibitörü için kullanılabilir veya ayarlanmalıdır. Test edilmiş GST inhibitörüdokuz konsantrasyonları hazırlayın.
148 mikrolitre PBS ve 20 mikrolitre GSH'den oluşan deneme çözümünün 25 nanomolar'da tek bir reaksiyon için hazırlanın. Çözeltiyi iyice karıştırın. Test kuyuları için iki mikrolitre GST inhibitörü, 20 mikrolitre GST, mil başına 0,1 birim ve 168 mikrolitre test çözeltisi ekleyin.
Kontrol kuyuları için, GST inhibitörü için kullanılan iki mikrolitre, mil başına 0,1 birim GST 20 mikrolitre ve 168 mikrolitre istiğar çözeltisi ekleyin. Boş kuyular için, GST inhibitörü için kullanılan iki mikrolitre dilüent, 20 mikrolitre su ve 168 mikrolitre istiğar çözeltisi ekleyin. Boş da dahil olmak üzere her kuyu için 10 mikrolitre CDNB çözeltisi ekleyin.
Birkaç saniye çalkalayıcı üzerinde karıştırın. Emiciliği dakikada 340 nanometre de 10 dakika boyunca kaydedin. IC50'yi özel bir yazılımla hesaplayın.
Protokolde açıklandığı gibi farklı konsantrasyonlarda dört CDNB çözeltisi hazırlayın. Protokolde açıklandığı gibi farklı konsantrasyonlarda üç GST inhibitörü çözeltisi hazırlayın. 148 mikrolitre PBS ve 20 mikrolitre GSH içeren enzimatik solüsyonları 25 milimolar'da tek bir reaksiyon için hazırlayın.
Kontrol kuyuları için, GST inhibitörü için kullanılan dilüent iki mikrolitre ekleyin. Ve test ve boş kuyular için, doğru GST inhibitörü çözeltisinin iki mikrolitresi. Birkaç saniye karıştırın.
Her kuyuya enzimatik çözeltinin 168 mikrolitresini ekleyin. Her bir kuyuya ilgili CDNB konsantrasyonlarından 10 mikrolitre ekleyin. Birkaç saniye karıştırın, sonra 10 dakika boyunca her dakika 340 nanometre de emici kaydedin.
GST inhibitörü üç farklı konsantrasyonları boyunca CDNB dört farklı konsantrasyonları kullanmak için aynı kaplama deseni kullanarak deneyi tekrarlayın. İnhibisyon modunu belirlemek için özel bir yazılım ile sonuçları analiz, yanı sıra Ki.This protokolü curcumin, antikanser özellikleri olan bir molekül uygulandı. Bu bileşik, birkaç GST isoforms için bağlayıcı yakınlık hesaplamalı tahminler tarafından seçildi.
Buna paralel olarak, aynı deneyler etakiyonik asit üzerinde yapılmıştır, pozitif kontrol olarak laboratuvar ortamında en yaygın olarak kullanılan GST inhibitörü. Inhibitör potens at karaciğerGTs bir havuz üzerinde test edildi ve seçim herhangi bir GST izoforms uygulanabilir. IC 50 yanı sıra inhibisyon türü ve Ki belirlendi.
En iyi titre koşullarını sağlamak için, ilk olarak Michaelis-Menten sabiti, Km substrat CDNB ile gst havuzu belirlendi. Km substrat ve enzim arasındaki yakınlığı temsil eder. Bu değerin belirlenmesi kompozisyon için doymak bilmeyen bir konsantrasyon kullanmak için çok önemlidir.
Aslında, iki yüksek konsantrasyonları rekabetçi inhibitörleri dezavantaj olabilir, çok az miktarda tespit edilemez ise. Bu konuda daha fazla bilgi için lütfen metinlere bakın. Bu deney için, gsh ve GST enzimlerinin sabit konsantrasyonu ile altı farklı CDNB konsantrasyonu kullanıldı.
Michaelis-Menten grafiği, X ekseninde milimolar içindeki substrat konsantrasyonları ve Y ekseninde dakikada milimolar içindeki hızın çizilmesiyle elde edilmiştir. Reaksiyonun hızı birinci denklemle hesaplandı. Km yarım Vmax olarak belirlenir, eşledik oluşumu bir plato elde etmek için substrat ile çözelti doygunluğu sonra elde edilen bir değer.
Test edilen GST enzimatik çözeltisi için CDNB km özel bir yazılım ile hesaplamalar dayalı 0,26 milimolar olarak belirlenmiştir. IC50, enzim aktivitesini yarı yarıya inhibe etmek için gereken maddenin konsantrasyonu olarak tanımlanır. IC50, GST inhibitörülogunun logaritmik konsantrasyonunun X ekseninde çizildiği ve Y eksenindeki GST aktivitesinin yüzdesi ile doğrusal olmayan bir regresyon grafiği kullanılarak tahmin edilmiştir.
Dokuz farklı inhibitör konsantrasyonu kullanıldı. GST etkinliği birinci denklemin uygulanması ile belirlenmiştir. Sonuçlar hiçbir inhibitör ile kontrol kullanılarak normale döndü.
Curcumin suda kötü çözünür. Böylece daha yüksek konsantrasyonlarda kullanımı mümkün değildi, bu da maksimum inhibisyon elde etmeyi zorlaştırdı. Yine de, özel bir yazılım 31,4 mikromolar değerinde GST bu havuz için müfredat IC50 tahmin başardı.
Buna paralel olarak, aynı deney pozitif kontrol olarak etakronik asit ile yapılmıştır. Beklendiği gibi, bu molekül 6.7 mikromolar bir IC50 ile bir GST inhibitörü olarak doğrulandı. Bu sonuçlar kurkumin inyanıküzere mikromolar aralığında bir IC50 ile bir GST inhibitörü olduğunu doğruladı, etacrynic asit benzer.
Bir GST inhibitörü olarak ayrıntılı curcumin çalışmak için, inhibisyon türü, hem de inhibisyon sabiti, Ki, belirlendi. İlk olarak, inhibisyon türü Michaelis-Menten grafikleri ile değerlendirildi. GST inhibitörü konsantrasyonları artarken substrat CDNB farklı konsantrasyonlarda kullanarak, Kms önemli ölçüde curcumin konsantrasyonları ile korelasyon arttı Vmax değişen koşullara rağmen değişmeden kaldı.
Bu inhibisyon modu, rekabetçi bir inhibisyon modunun tipik bir nedenidir. Diğer engelleme türleri hakkında daha fazla bilgi için lütfen metne bakın. Ki buna göre curcumin 23.3 mikromolar değeri sağlayan, aynı veri seti kullanılarak inhibisyon türüne göre hesaplanmıştır.
Açıklanan yöntemler, doğru ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlamak için belirli adımlarla dikkatlilik gerektiren temel enzimatik denemelerdir. Michaelis-Menten sabit km belirlenmesi, enzim için substrat yakınlık gösteren önemli adımlardan biridir. Aslında, substrat konsantrasyonu çok yüksek veya çok düşük olduğunda, inhibisyon doğru modu belirlemek zor hale getirir ve Ki doğru hesaplanmaz.
Bu prosedür insan rekombinant GST'ler uygulanabilir, örnek OLARAK GSTA1 ve P1 biri, ilaç direncini azaltmak için elektrofilik ajanlar ile birlikte kullanılacak potansiyeli değerlendirmek için hücre kültürü çalışmalarında kullanılır.
