גלוטתיון S-transferases, GSTs, הם אנזימים מטבוליים המשפילים תרכובות אלקטרופיליות תאיים ומקיימים אינטראקציה עם MAP kinases המעורבים במסלול אפופטוזיס. בגלל שני תפקידים אלה של ביטוי של GST מתואם עם עמידות לתרופות, פתרון כדי לנטרל את הבעיה היא להשתמש מעכבי אנזימטי. עם פרוטוקול זה, אנו מספקים דרך לבדוק מולקולות כאלה.
שיטה זו מיועדת לכל מי שחדש בתחום מעכבי GST, המעוניינים להשתמש בשיטה מהירה וקלה לבדיקת האינטראקציה של תרכובת האנזים. אנו מספקים גם את השלבים כדי לקבוע שני מאפיינים של מעכב, ריכוז מעכבות 50, IC50, ואת קבוע של עיכוב, Ki.As היטב תיארנו את הטכניקה כדי להגדיר את אופן העיכוב, תכונה חשובה שיש לה השלכות ביולוגיות שונות. הצעד הראשון הוא לקבוע את הפעילות האנזימטית של GST בפתרון ליחידה.
יחידה אחת למיל היא נפח האנזים הדרוש לסנתז מיקרומולר אחד של מוצר לדקה. לכמת את ריכוז החלבון של פתרון האנזים. בחר את הטכניקה בהתאם לנוחיותך.
מדללים את תותר החלבון לריכוז סופי של 0.02 מיליגרם למיל במים. שמור את הפתרון האנזימטי על קרח. הכינו את התגובה בצלחת של 96 בארות.
מוסיפים 20 מיקרוליטרים של מים ל בארות הריקות. הוסיפו 20 מיקרוליטרים של הפתרון האנזימטי ל בארות הבדיקה. הוסף 20 מיקרוליטרים של GSH.
הוסף 150 מיקרוליטרים של PBS. הוסף 10 מיקרוליטרים של CDNB ב 50 מילימולר לתוך כל באר. מערבבים את הצלחת על שייקר לכמה שניות.
עם קורא לוחות ספקטרופוטומטרי, להקליט את הספיגה ב 340 ננומטר כל דקה במשך 10 דקות. נתח את התוצאות בגיליון אלקטרוני ועם תוכנה מיוחדת. על פי התוצאות שהתקבלו, להכין פתרון מניית GST ב 0.1 יחידות לכל מיל במים.
הכינו שישה ריכוזים שונים של CDNB 20 פעמים ב-95%אתנול בנפח סופי של 200 מיקרוליטרים. לתוך כל באר, להוסיף 20 microliters של GSH ב 25 מילימולר. ל בארות הבדיקה, להוסיף 20 microliters של GST ב 0.1 יחידה למיל.
ל בארות הריקות, הוסיפו 20 מיקרוליטרים של מים. לתוך כל באר, להוסיף 150 microliters של PBS. לבארבות הבדיקה ולבאות הריקות, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של פתרון CDNB המתאים.
כל ריכוז של CDNB צריך ריק ספציפי. מערבבים את התוכן על שייקר במשך כמה שניות, להקליט את הספיגה ב 340 ננומטר כל דקה במשך 10 דקות. נתח את התוצאות באמצעות תוכנה מיוחדת.
לקבוע את הקילומטר על ידי ציור עלילה מיכאליס-מטן. על פי התוצאות, להכין פתרון CDNB ב 20 פעמים ק"מ המתקבל ב 95%אתנול. לדלל את פתרון המעכב לריכוז הנדרש.
בצלחת 96 באר, להוסיף שני microliters של מעכב GST פוטנציאלי. ל בארות הריקות, הוסיפו שני מיקרוליטרים של הדילואנט. הוסף 20 microliters של GSH ב 25 מילימולר לתוך כל באר ו 168 microliters של PBS.
הוסף 10 microliters של CDNB 20 פעמים ק"מ נמצא במהלך השלב הקודם. מערבבים את הצלחת על שייקר לכמה שניות. תקליט את הספיגה ב-340 ננומטר כל דקה במשך 10 דקות.
נתח את התוצאות באמצעות תוכנה מיוחדת. על פי התוצאות, אותו ריק יכול לשמש עבור כל מעכב GST או חייב להיות מותאם. הכן תשעה ריכוזים של מעכב GST שנבדק.
הכן את פתרון החיבור המורכב 148 microliters של PBS ו 20 microliters של GSH ב 25 nanomolar לתגובה אחת. מערבבים היטב את הפתרון. עבור בארות הבדיקה, להוסיף שני microliters של מעכבי GST, 20 microliters של GST, 0.1 יחידה למיל, ו 168 microliters של פתרון הבדיקה.
עבור בארות הבקרה, להוסיף שני microliters של diluent המשמש מעכבי GST, 20 microliters של GST 0.1 יחידה למיל, ו 168 microliters של פתרון assay. עבור בארות ריקות, להוסיף שני microliters של diluent המשמש מעכבי GST, 20 microliters של מים 168 microliters של פתרון המוצג. הוסף 10 מיקרוליטרים של פתרון CDNB עבור כל באר, כולל הריק.
מערבבים על השייקר לכמה שניות. תקליט את הספיגה ב-340 ננומטר כל דקה במשך 10 דקות. חשב את ה- IC50 באמצעות תוכנה מיוחדת.
הכן ארבעה פתרונות CDNB בריכוזים שונים כפי שמוסבר בפרוטוקול. הכן שלושה פתרונות מעכבי GST בריכוזים שונים, גם כפי שמוסבר בפרוטוקול. הכינו את הפתרונות האנזימטיים המכילים 148 מיקרוליטרים של PBS ו-20 מיקרוליטרים של GSH ב-25 מילימולרים לתגובה אחת.
עבור בארות הבקרה, להוסיף שני microliters של diluent המשמש מעכבי GST. ולבדיקה ובירות ריקות, שני מיקרוליטרים של פתרון מעכבי GST הנכון. מערבבים לכמה שניות.
הוסיפו 168 מיקרוליטרים של הפתרון האנזימטי לכל באר. הוסף 10 microliters של ריכוזי CDNB המתאימים לתוך כל באר בהתאמה. מערבבים במשך כמה שניות, ולאחר מכן להקליט את הספיגה ב 340 ננומטר כל דקה במשך 10 דקות.
חזור על הניסוי באמצעות אותו דפוס ציפוי על מנת להשתמש בארבעה ריכוזים שונים של CDNB לאורך שלושת הריכוזים השונים של מעכב GST. לנתח את התוצאות עם תוכנה מיוחדת כדי לקבוע את מצב העיכוב, כמו גם את הפרוטוקול Ki.This הוחל על כורכומין, מולקולה עם תכונות נגד סרטן. תרכובת זו נבחרה על-ידי תחזיות חישוביות של זיקה לאיגוד עבור מספר צורות GST.
במקביל, אותם ניסויים נערכו על חומצה אתקרינית, מעכב GST הנפוץ ביותר בסביבת המעבדה כבקרה חיובית. העוצמה המעכבת נבדקה על מאגר של GSTs מכבד סוסים ו ניתן להחיל על כל isoforms GST של בחירה. IC 50, כמו גם את סוג העיכוב ואת Ki נקבעו.
על מנת לספק את תנאי ההתמדה הטובים ביותר, ראשית, מיכאליס-מנסטן קבוע, ק"מ של CDNB המצע עם מאגר של GSTs נקבע. ק"מ מייצג את הזיקה בין המצע לאנזים. קביעת ערך זה חיונית על מנת להשתמש בריכוז לא רווי לחיבור.
למעשה, שני ריכוזים גבוהים עלולים לדכא מעכבים תחרותיים, ואילו כמות קטנה מדי לא תהיה ניתנת לגילוי. נא עיין בהודעות לקבלת פרטים נוספים על כך. עבור ניסוי זה, שישה ריכוזים שונים של CDNB שימשו עם ריכוז קבוע של אנזימי GSH ו- GST.
הגרף מיכאליס-מאנטן הושג על ידי התוויית ריכוזי המצעים במילימולר על ציר ה- X והמהירות במילימולר לדקה על ציר ה- Y. מהירות התגובה חושבה במשוואה 1. ק"מ נקבע כחצי Vmax, ערך המתקבל לאחר רוויה של הפתרון עם המצע על מנת לקבל מישור של היווצרות חידה.
ק"מ של CDNB עבור הפתרון אנזימטי GST נבדק נקבע כמו 0.26 מילימולר מבוסס על חישובים עם תוכנה מיוחדת. IC50 מוגדר כריכוז החומר הדרוש כדי לעכב את פעילות האנזים בחצי. IC50 הוערך באמצעות גרף רגרסיה לא ליניארי שבו הריכוז הלוגאריתמי של מעכב GST התווה על ציר X ועל אחוז פעילות GST על ציר Y.
תשעה ריכוזים שונים של מעכב שימשו. פעילות GST נקבעה עם יישום של משוואה אחת. התוצאות היו מנורמל באמצעות הפקד עם מעכב ללא.
כורכומין הוא מסיס קשה במים. לכן ריכוזים גבוהים יותר לא ניתן היה להשתמש, מה שהופך אותו קשה להשיג עיכוב מקסימלי. אף על פי כן, תוכנה מיוחדת הצליחה לחזות את IC50 של תוכנית הלימודים עבור מאגר זה של GST בערך של 31.4 micromolar.
במקביל, אותו ניסוי נערך עם חומצה אתקרינית כשליטה חיובית. כצפוי, מולקולה זו אושרה כמעכב GST עם IC50 של 6.7 micromolar. תוצאות אלה אישרו כי כורכומין הוא גם מעכב GST עם IC50 בטווח micromolar, בדומה לחומצה ethacrynic.
כדי ללמוד יותר בפירוט כורכומין כמעכב GST, סוג של עיכוב, כמו גם את קבוע של עיכוב, קי, נקבעו. ראשית, סוג העיכוב הוערך עם גרפי מיכאליס-מטן. על ידי שימוש בריכוזים שונים של CDNB המצע תוך הגדלת הריכוזים של מעכב GST, Kms גדל באופן משמעותי בקורלציה עם ריכוזי כורכומין בעוד Vmax נשאר ללא שינוי למרות התנאים המשתנים.
מצב זה של עיכוב אופייני למצב תחרותי של עיכוב. לפרטים נוספים על סוגים אחרים של עכבות, עיין בטקסט. Ki חושב בהתאם על סמך סוג העיכוב באמצעות אותה ערכת נתונים, מתן ערך של 23.3 micromolar של כורכומין.
השיטות המוסברות הן מאמרים אנזימטיים בסיסיים, הדורשים זהירות באמצעות צעדים מסוימים על מנת לספק תוצאות נכונות ובלתי ניתנות לשחזור. קביעת ק"מ הקבוע מיכאליס-מטן, המטה את זיקה המצע לאנזים היא אחד הצעדים המכריעים. למעשה, כאשר ריכוז המצע גבוה מדי או נמוך מדי, הוא מקשה על זיהוי מצב העיכוב הנכון וקי אינו מחושב כראוי.
הליך זה יכול להיות מיושם על GSTs רקומביננטי אנושי, כדוגמה GSTA1 ואחד P1, משמשים במחקרים תרבות התא כדי להעריך את הפוטנציאל לשמש בשילוב עם סוכנים אלקטרופיליים כדי להפחית את עמידות לתרופות.
