I glutationi S-transferasi, GST, sono enzimi metabolici che degradano i composti elettrofili intracellulari e interagiscono con le MAP chinasi coinvolte nella via dell'apoptosi. A causa di questi due ruoli di espressione della GST è correlato con la resistenza ai farmaci, una soluzione per contrastare questo problema è utilizzare inibitori enzimatici. Con questo protocollo, forniamo un modo per testare tali molecole.
Questo metodo è rivolto a tutti coloro che sono nuovi nel campo degli inibitori della GST, che desiderano utilizzare un metodo rapido e semplice per esaminare l'interazione enzima-composto. Forniamo anche i passaggi per determinare due caratteristiche di un inibitore, la concentrazione inibitoria 50, IC50 e la costante di inibizione, Ki.As beh abbiamo descritto la tecnica per definire il modo di inibizione, una caratteristica importante che ha diverse conseguenze biologiche. Il primo passo è determinare l'attività enzimatica della GST in soluzione per unità.
Un'unità per mil è il volume di enzima necessario per sintetizzare un micromolare di prodotto al minuto. Quantificare la concentrazione proteica della soluzione enzimatica. Scegli la tecnica in base alla tua convenienza.
Diluire la soluzione proteica a una concentrazione finale di 0,02 milligrammi per mil in acqua. Mantenere la soluzione enzimatica sul ghiaccio. Preparare la reazione in una piastra da 96 po'.
Aggiungere 20 microlitri di acqua per i pozzi vuoti. Aggiungere 20 microlitri della soluzione enzimatica per i pozzi di prova. Aggiungere 20 microlitri di GSH.
Aggiungere 150 microlitri di PBS. Aggiungere 10 microlitri di CDNB a 50 millimolari in ogni pozzo. Mescolare la piastra su uno shaker per alcuni secondi.
Con un lettore di lastre spettrofotometriche, registrare l'assorbanza a 340 nanometri ogni minuto per 10 minuti. Analizzare i risultati in un foglio di calcolo e con un software specializzato. Secondo i risultati ottenuti, preparare una soluzione di stock GST a 0,1 unità per mil in acqua.
Preparare sei diverse concentrazioni di CDNB 20 volte in etanolo al 95% in un volume finale di 200 microlitri. In ogni pozzo aggiungere 20 microlitri di GSH a 25 millimolari. Ai pozzi di prova aggiungere 20 microlitri della GST a 0,1 unità per mil.
Ai pozzi vuoti, aggiungere 20 microlitri d'acqua. In ogni pozzo aggiungere 150 microlitri di PBS. Ai pozzi di prova e ai pozzi vuoti, aggiungere 10 microlitri della corrispondente soluzione CDNB.
Ogni concentrazione di CDNB ha bisogno di un vuoto specifico. Mescolare il contenuto su uno shaker per alcuni secondi, registrare l'assorbanza a 340 nanometri ogni minuto per 10 minuti. Analizza i risultati con un software specializzato.
Determinare il Km disegnando una trama di Michaelis-Menten. Secondo i risultati, preparare una soluzione CDNB a 20 volte il Km ottenuto nel 95% di etanolo. Diluire la soluzione inibitore alla concentrazione richiesta.
In una piastra da 96 po', aggiungere due microlitri del potenziale inibitore della GST. Ai pozzi vuoti, aggiungere due microlitri del diluente. Aggiungere 20 microlitri di GSH a 25 millimolari in ogni pozzo e 168 microlitri di PBS.
Aggiungere 10 microlitri di CDNB 20 volte Km trovati durante il passaggio precedente. Mescolare la piastra su uno shaker per alcuni secondi. Registrare l'assorbanza a 340 nanometri ogni minuto per 10 minuti.
Analizza i risultati con un software specializzato. In base ai risultati, lo stesso bianco può essere utilizzato per ogni inibitore della GST o deve essere regolato. Preparare nove concentrazioni dell'inibitore GST testato.
Preparare la soluzione saggia composta da 148 microlitri di PBS e 20 microlitri di GSH a 25 nanomolari per una reazione. Mescolare bene la soluzione. Per i pozzi di prova, aggiungere due microlitri di inibitore della GST, 20 microlitri di GST, 0,1 unità per mil e 168 microlitri della soluzione di dosaggio.
Per i pozzi di controllo, aggiungere due microlitri del diluente utilizzato per l'inibitore della GST, 20 microlitri di unità GST 0,1 per mil e 168 microlitri della soluzione di dosaggio. Per i pozzi vuoti, aggiungere due microlitri del diluente utilizzato per l'inibitore della GST, 20 microlitri di acqua e 168 microlitri della soluzione di dosaggio. Aggiungere 10 microlitri della soluzione CDNB per ogni pozzo, incluso il vuoto.
Mescolare sullo shaker per alcuni secondi. Registrare l'assorbanza a 340 nanometri ogni minuto per 10 minuti. Calcola l'IC50 con un software specializzato.
Preparare quattro soluzioni CDNB a diverse concentrazioni, come spiegato nel protocollo. Preparare tre soluzioni inibitorie GST a diverse concentrazioni, anche come spiegato nel protocollo. Preparare le soluzioni enzimatiche contenenti 148 microlitri di PBS e 20 microlitri di GSH a 25 millimolari per una reazione.
Per i pozzi di controllo, aggiungere due microlitri del diluente utilizzato per l'inibitore della GST. E per il test e pozzi vuoti, due microlitri della corretta soluzione inibitore GST. Mescolare per alcuni secondi.
Aggiungere 168 microlitri della soluzione enzimatica ad ogni pozzo. Aggiungere 10 microlitri delle corrispondenti concentrazioni di CDNB in ciascun pozzo. Mescolare per alcuni secondi, quindi registrare l'assorbanza a 340 nanometri ogni minuto per 10 minuti.
Ripetere l'esperimento utilizzando lo stesso modello di placcatura per utilizzare le quattro diverse concentrazioni di CDNB lungo le tre diverse concentrazioni di inibitore della GST. Analizzare i risultati con un software specializzato per determinare la modalità di inibizione, così come il Ki.Questo protocollo è stato applicato alla curcumina, una molecola con proprietà anticancro. Questo composto è stato selezionato da previsioni computazionali dell'affinità di associazione per diverse isoforme GST.
Parallelamente, gli stessi esperimenti sono stati condotti sull'acido ethacrynico, l'inibitore della GST più utilizzato nell'ambiente di laboratorio come controllo positivo. La potenza inibitoria è stata testata su un pool di GST dal fegato equino e può essere applicata a qualsiasi isoforma GST di scelta. Sono stati determinati l'IC 50 così come il tipo di inibizione e il Ki.
Al fine di fornire le migliori condizioni di dosaggio, in primo luogo, la costante di Michaelis-Menten, è stato determinato Km del SUBSTRATO CDNB con un pool di GST. Km è rappresentativo dell'affinità tra il substrato e l'enzima. La determinazione di questo valore è fondamentale per utilizzare una concentrazione non saturante per il saggio.
In effetti, due alte concentrazioni potrebbero svantaggiare gli inibitori della concorrenza, mentre una quantità troppo piccola non sarà rilevabile. Si prega di consultare i testi per maggiori dettagli su questo. Per questo esperimento, sono state utilizzate sei diverse concentrazioni di CDNB con una concentrazione fissa di enzimi GSH e GST.
Il grafico di Michaelis-Menten è stato ottenuto tracciando le concentrazioni del substrato in millimolare sull'asse X e la velocità in millimolare per minuto sull'asse Y. La velocità della reazione è stata calcolata con l'equazione uno. Km è determinato come mezzo Vmax, un valore ottenuto dopo la saturazione della soluzione con il substrato al fine di ottenere un altopiano di formazione coniugata.
Il Km di CDNB per la soluzione enzimatica GST testata è stato determinato come 0,26 millimolare sulla base di calcoli con un software specializzato. IC50 è definito come la concentrazione di sostanza necessaria per inibire l'attività enzimatica della metà. IC50 è stato stimato utilizzando un grafo di regressione non lineare in cui la concentrazione logaritmica dell'inibitore della GST è stata tracciata sull'asse X e la percentuale di attività GST sull'asse Y.
Sono state utilizzate nove diverse concentrazioni di inibitore. L'attività GST è stata determinata con l'applicazione dell'equazione uno. I risultati sono stati normalizzati utilizzando il controllo senza inibitore.
La curcumina è scarsamente solubile in acqua. Pertanto non sono state possibili concentrazioni più elevate, rendendo difficile ottenere la massima inibizione. Tuttavia, un software specializzato è stato in grado di prevedere l'IC50 del curriculum per questo pool di GST per un valore di 31,4 micromolare.
Parallelamente, lo stesso esperimento è stato condotto con acido ethacrynico come controllo positivo. Come previsto, questa molecola è stata confermata come inibitore della GST con un IC50 di 6,7 micromolare. Questi risultati hanno confermato che la curcumina è anche un inibitore della GST con un IC50 nell'intervallo micromolare, simile all'acido ethacrynico.
Per studiare più in dettaglio la curcumina come inibitore della GST, sono stati determinati il tipo di inibizione, così come la costante di inibizione, Ki. In primo luogo, il tipo di inibizione è stato valutato con i grafici di Michaelis-Menten. Utilizzando diverse concentrazioni del substrato CDNB aumentando al contempo le concentrazioni dell'inibitore della GST, Kms è aumentato significativamente in correlazione con le concentrazioni di curcumina mentre Vmax è rimasto invariato nonostante le diverse condizioni.
Questa modalità di inibizione è tipica di una modalità competitiva di inibizione. Per ulteriori dettagli sugli altri tipi di inibizioni, fare riferimento al testo. Ki è stato calcolato di conseguenza in base al tipo di inibizione utilizzando lo stesso set di dati, fornendo un valore di 23,3 micromolare di curcumina.
I metodi spiegati sono saggi enzimatici di base, che richiedono attenzione attraverso determinati passaggi al fine di fornire risultati corretti e riproducibili. La determinazione della costante di Michaelis-Menten Km, che delinea l'affinità del substrato con l'enzima è uno dei passaggi cruciali. Infatti, quando la concentrazione del substrato è troppo alta o troppo bassa, rende difficile identificare la corretta modalità di inibizione e Ki non viene calcolato correttamente.
Questa procedura può essere applicata ai GST ricombinanti umani, come ad esempio GSTA1 e uno di P1, sono utilizzati negli studi di coltura cellulare per valutare il potenziale da utilizzare in combinazione con agenti elettrofili per ridurre la resistenza ai farmaci.
