Этот метод позволяет определить естественный метаболизм клеток-убийц. Ключевой параметр активации путем измерения потребления кислорода и изменений рН в внеклеточной среде. Преимущество внеклеточного анализатора потока в том, что он полностью автоматизирован и способен тестировать до 92 образцов в режиме реального времени с небольшим количеством клеток.
Таким образом, позволяя высокой пропускной способности экранов. Действительный метод определения гликолиза и дыхания в сложных клетках очень важен в клинике. Поскольку Есть много заболеваний, включая ожирение и рак, где метаболизм иноверных клеток нарушается.
Начните с пипетки 20 миллилитров лимфоцитов разделения среды в 50 миллилитров конической трубки. Сохраняя трубку под углом 30 градусов, аккуратно пипетка 20 миллилитров крови над средой. Создание видимого и четко определенного интерфейса между двумя жидкостями.
Центрифуга труб в течение 25 минут при 1000 раз G.Then тщательно взять трубки из центрифуги и поместить их в стойку. Проверьте наличие заметного слоя клеток на стыке LSM и плазмы. Аккуратно аспирировать моноядерный слой клетки с 10 миллилитров пластиковой пипетки и поместить его в новую 50 миллилитров конической трубки.
Вымойте моноядерные клетки дважды с 45 миллилитров PBS. И центрифуга их на 800 раз G в течение пяти минут. Чтобы изолировать естественные клетки-убийцы или энгавы, подсчитайте моря PVM и повторно посчитайте их в буфере разделения НК в один раз от 10 до восьмого ячейки на миллилитр.
Затем перенесите 10 миллилитров клеточной подвески в новую 50-миллилитровую трубку. Добавьте 500 микролитров смеси антител НК-клеток. И 10 микролитров анти CD три положительные смеси антител изоляции к PBMCs.
И инкубировать их при комнатной температуре в течение 10 минут. Вихрь магнитных бусин и добавить один миллилитр для ПКМ И антител. Затем инкубировать MIGS в течение 10 минут при комнатной температуре с редким перемешиванием.
Добавьте 35 миллилитров буфера изоляции НК и поместите трубку на магнит на 15 минут. Тщательно соберите супернатант с 50 миллилитров пластиковой пипетки, не касаясь сторон или нижней части трубки. Подсчитайте клетки и центрифуга их на 800 раз G в течение пяти минут.
Для стимуляции НК-клеток с растворимым проходом 15, повторно 750 000 клеток в 100 микролитров IMDM, содержащих 10%HS в колодец 96 пластины. Разбавить человеческий проход от 15 до одного микрограмма на миллилитр в IMDM и 10%HS. И добавить 100 микролитров разбавленного прохода человека 15 к клеткам.
Ремонт контрольного образца с нестимулированных клеток и место обоих образцов в инкубаторе на 37 градусов по Цельсию. Стимулировать клетки в течение 48 часов, а затем выполнить внеклеточный анализ потока. За день до эксперимента включите анализатор и дайте ему прогреться до 37 градусов по Цельсию.
Откройте пакет картриджа цензора и отделить картридж от утилиты пластины. Затем добавьте 200 микролитров раствора калибранта к каждой пластине утилиты. И поместите центральный картридж обратно в убедившись, что датчики полностью погружены.
Для достижения оптимальных результатов инкубировать картридж на ночь при 37 градусах по Цельсию в инкубаторе без двуокиси углерода. Который правильно увлажняется. Для приготовления клея покрытием лезвие, пипетка 25 микролитров клеточного клея раствор для каждого колодец пластины.
И инкубируется при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем снимите раствор и промойте пластину дважды 200 микролитров стерильной воды на колодец. Держите пластину открытой в течение 15 минут внутри капота клеточной культуры, чтобы колодцы высохли.
Центрифуга ранее изолированных нк-клеток добавить 200 раз G в течение пяти минут. Затем удалите супернатанты и промыть клетки в разогретой митохондриальной среде стресс-теста или гликолиза стресс-теста среды. Пеллет клетки снова и повторно их предпочтительной концентрации клеток в той же среде.
Положите 180 микролитров клеточной подвески на колодец в анализную пластину. Используйте скважины A one, A 12 H one и H 12 в качестве контрольных скважин для фоновой коррекции. Добавление 180 микролитров среды анализа к этим скважинам инкубировать пластину в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию в инкубаторе без двуокиси углерода.
Центрифуга пластины при 200 раз G в течение пяти минут. Затем наблюдайте за клетками под микроскопом, чтобы проверить, что они образуют слой мано в нижней части колодец. Инкубировать клетки в течение еще 25 минут.
Теплые рабочие решения до 37 градусов по Цельсию. И скорректировать их рН до 7,4, если это необходимо. Загрузите ранее подготовленные соединения для митохондриального стресс-теста или для стресс-теста гликолиза в доски A, B и C гидратированного картриджа цензора Положите загруженный картридж цензора обратно в инкубатор при настройке программы.
Чтобы настроить протокол анализа внеклеточного потока, откройте программное обеспечение и используйте определения группы для определения условий предварительной обработки. Используйте вкладку карты плиты, чтобы указать группы скважин, которые имеют аналогичные условия, также указывают на фоновую коррекцию и пустые скважины. Затем установите программу во вкладке протоколов.
Запустите программу и поместите сенсорный картридж и утилиту пластины на лоток. После шага калибровки замените калибрантную пластину на анализную пластину на прикрепленные клетки. После завершения времени вы получите данные и проанализируйте их.
Для оценки чистоты и жизнеспособности НК-клеток. Малый Алек Уоттс из морей PVM и изолированной популяции клеток НК были окрашены и проанализированы потоком цитометрии. Чистота популяции ячеек НК была установлена путем двойного пребывания против CD 3 и CD 56 или NKP 46.
Много митохондриальной скорости потребления кислорода для клеток НК человека показаны здесь. Как и ожидалось, номера ячеев I отображаются более высокими значениями OCR. Номера клеток также линейно коррелируют с количеством ДНК или белка в колодец.
С другой стороны более высокие номера клетки не были оптимальны. Потому что после добавления DNP, концентрация кислорода в оке была полностью истощена в каждом цикле. Что помешало точному расчету OCR.
В клетках НК человека, 100 микромоляных DNP было установлено, что оптимальная доза. Здесь показан типичный эксперимент митохондриального стресс-теста с 750 000 НК-клеток на колодец. В этом тесте олигомицин приводит к резкому снижению потребления кислорода.
И увеличение ECAR. Что представляет собой переход на гликолиз и усилия по поддержанию клеточного уровня АТФ. Активация НК-клеток по проходу 15 вызвала увеличение как потребления митохондриального кислорода, так и внеклеточного подкисления.
Базальный Максималь и АТФ связаны дыхание увеличилось, но не протон утечки или не митохондриального дыхания. Кроме того, скорость OCR/ECA снизилась, что свидетельствует о переходе к гликолитическому метаболизму после стимуляции IL 15. При выполнении этого протокола очень важно получить чистую и здоровую популяцию клеток, чтобы определить оптимальное количество клеток и определить концентрацию uncablers.
