이 방법은 자연 킬러 세포 대사의 결정을 허용합니다. 세포외 배지의 산소 소비 및 pH 변화를 측정하여 활성화의 주요 매개 변수. 세포외 플럭스 분석기의 장점은 완전히 자동화되어 낮은 양의 세포로 실시간으로 최대 92개의 샘플을 테스트할 수 있다는 것입니다.
따라서 높은 처리량 화면을 허용합니다. 엉뚱한 세포에서 글리코리시및 호흡을 결정하는 유효한 방법은 진료소에서 매우 중요합니다. 비만과 암 등 많은 질병이 있기 때문에, 세포 대사가 손상됩니다.
림프구 분리 배지 의 20 밀리리터를 50 밀리리터 원내 튜브로 파이프로 전환하여 시작합니다. 튜브를 30도 각도로 유지하면서, 부드럽게 파이펫 20 밀리리터의 혈액을 매체에 걸쳐. 두 유체 간에 표시되고 잘 정의된 인터페이스를 만듭니다.
1000회 G.G.에서 25분 동안 튜브를 원심분리한 다음 조심스럽게 원심분리기에서 튜브를 꺼내 랙에 넣습니다. LSM과 플라즈마 사이의 인터페이스에서 눈에 띄는 세포 층의 존재를 확인합니다. 10 밀리리터 플라스틱 파이펫으로 단일 핵 세포 층을 부드럽게 흡인하고 새로운 50 밀리리터 원판 튜브에 놓습니다.
PBS의 45 밀리리터로 단핵 세포를 두 번 세척하십시오. 그리고 원심 분리는 5 분 동안 800 배 G에서 그들을 분리합니다. 천연 킬러 세포 또는 engaves를 격리하려면 PVM 바다를 계산하고 밀리리터 당 8 번째 세포로 10 번 NK 분리 버퍼로 재보힙하십시오.
그런 다음 세포 현탁액의 10 밀리리터를 새로운 50 밀리리터 튜브로 옮킨다. NK 세포 절연 항체 믹스의 500 마이크로 리터를 추가합니다. 및 항체 CD 3개의 양성 절연 항체 믹스의 10 마이크로리터가 PBMC에 혼성한다.
그리고 10 분 동안 실온에서 그들을 배양. 소용돌이 자기 구슬과 PBMC 및 항체에 1 밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 MIGS를 실온에서 10분 동안 배양하고 가끔 교반합니다.
NK 절연 버퍼 35밀리리터를 추가하고 튜브를 자석에 15분간 놓습니다. 튜브의 측면이나 바닥을 건드리지 않고 50 밀리리터 플라스틱 파이펫으로 상체를 조심스럽게 수집합니다. 세포를 계산하고 원심 분리기를 800 배 G에서 5 분 동안 계산합니다.
용해 통로(15)로 NK 세포를 자극하기 위해, 96웰 플레이트의 우물에서 10%HS를 함유하는 IMDM의 100마이크로리터에서 750, 000세포를 재중단한다. IMDM에서 밀리리터당 15~ 1마이크로그램의 인간 통로와 10%의 HS를 희석시하십시오. 그리고 희석 된 인간 통로 (15)의 100 마이크로 리터를 세포에 추가합니다.
자극되지 않은 세포로 제어 샘플을 복구하고 섭씨 37도에서 인큐베이터에 두 샘플을 배치합니다. 48 시간 동안 세포를 자극한 다음 세포 외 유행성 액수 분석작업을 수행합니다. 실험 전날 분석기를 켜고 섭씨 37도까지 따뜻하게 해보세요.
검열 카트리지 패키지를 열고 카트리지를 유틸리티 플레이트에서 분리합니다. 그런 다음 교정 용액의 200 마이크로리터를 유틸리티 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 그리고 센서가 완전히 침수되었는지 확인하기 위해 중앙 카트리지를 다시 넣습니다.
최적의 결과를 위해 이산화탄소 무료 인큐베이터에서 하룻밤 사이에 카트리지를 섭씨 37도에서 배양합니다. 어느 제대로 가습. 접착제 코팅 블레이드를 준비하기 위해, 플레이트의 각 웰에 셀 접착제 용액의 파이펫 25 마이크로리터.
실온에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 용액을 제거하고 200 마이크로 리터의 멸균 물로 접시를 두 번 씻습니다. 우물이 건조할 수 있도록 세포 배양 후드 내부에 15분 동안 접시를 열어 두십시오.
원심분리기 이전에 분리된 NK 셀은 5분 동안 200배 G를 추가합니다. 그런 다음 수퍼나티를 제거하고 온난한 미토콘드리아 스트레스 테스트 매체 또는 글리코리시스 응력 테스트 배지에서 세포를 세척합니다. 세포를 다시 펠렛하고 동일한 배지에서 선호하는 세포 농도로 다시 중단합니다.
180 마이크로리터의 셀 서스펜션을 분석 판에 잘 넣습니다. 웰 A 1, A 12 H 1 및 H 12를 배경 보정을 위한 컨트롤 웰로 사용하십시오. 이 Wells Incubate에 분석 매체의 180 마이크로리터를 첨가하여 이산화탄소 없는 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다.
5 분 동안 200 배 G에서 플레이트를 원심 분리합니다. 그런 다음 현미경의 밑에 세포를 관찰하여 우물 의 바닥에 마노 층을 형성하는지 확인합니다. 세포를 25분 동안 배양합니다.
섭씨 37도에 따뜻한 작업 솔루션. 필요한 경우 pH를 7.4로 재조정합니다. 미토콘드리아 응력 테스트를 위해 이전에 준비된 화합물을 로드하거나 글리콜리시스 응력 테스트를 위해 수화 된 검열 카트리지의 보드 A, B 및 C에 로드된 검열 카트리지를 인큐베이터에 다시 넣습니다.
세포외 플럭스 분석 프로토콜을 설정하려면 소프트웨어를 열고 그룹 정의를 사용하여 전처리 조건을 정의합니다. 플레이트 맵 탭을 사용하여 비슷한 조건이 있는 우물 그룹을 나타내기도 배경 보정 및 빈 우물을 나타냅니다. 그런 다음 프로토콜 탭에서 프로그램을 설정합니다.
프로그램을 시작하고 센서 카트리지와 유틸리티 플레이트를 트레이에 놓습니다. 교정 단계 후, 분석 플레이트의 교정판을 부착된 셀로 교체한다. 실행이 완료되면 데이터를 검색하고 분석합니다.
NK 세포의 순도와 생존가능성을 평가하기 위해. PVM 바다와 고립된 NK 세포 집단의 작은 알렉 와트는 유동 세포측정에 의해 염색되고 분석되었다. NK 세포 집단의 순도는 CD 3 및 CD 56 또는 NKP 46에 대해 이중 체류하여 확립되었다.
인간 NK 세포에 대한 미토콘드리아 산소 소비율이 많이 여기에 나와 있다. 예상대로 나는 셀 번호가 더 높은 OCR 값을 표시했다. 세포 수는 또한 우물에 있는 DNA 또는 단백질의 양과 선형적으로 상관.
다른 한편으로는 더 높은 세포 수는 최적이 아니었다. DNP를 추가하면 우물의 산소 농도가 각 주기마다 완전히 고갈되었기 때문입니다. 이로 인해 OCR의 정확한 계산이 방지되었습니다.
인간 NK 세포에서, 100 마이크로몰러 DNP는 최적의 용량으로 밝혀졌다. 750, 000 NK 세포를 잘 결합한 대표적인 미토콘드리아 스트레스 시험 실험이 여기에 나와 있다. 이 시험에서 올리고마이신은 산소 소비의 극적인 감소로 이어집니다.
그리고 ECAR의 증가. 이는 글리코리시스로의 전환과 세포 ATP 수준을 유지하기 위한 노력을 나타냅니다. 통로(15)에 의한 NK 세포의 활성화는 미토콘드리아 산소 소비와 세포외 산성화 모두에서 증가를 일으켰다.
기저 막시칼과 ATP 연결 호흡 증가 하지만 양성자 누출 또는 비 미토 콘 드리 아 호흡. 더욱이, OCR/ECA 속도는 IL 15 자극 후에 글리코리스틱 물질 대사로의 전환을 나타내는 감소. 이 프로토콜을 수행할 때, 최적의 세포 수를 결정하고 케이블의 농도를 적정화하기 위해 순수하고 건강한 세포 집단을 얻는 것이 매우 중요합니다.
