Os anticorpos são rotineiramente usados em técnicas de laboratório e suas aplicações terapêuticas e diagnósticas estão se expandindo rapidamente. A caracterização de ligação de antígeno e anticorpos rápido e preciso é criticamente importante para essas aplicações. A fotometria em massa mede rapidamente afinidades de ligação usando quantidades extremamente pequenas de material.
Não é necessária rotulagem ou imobilização e informações sobre oligomerização e pureza proteica podem ser obtidas a partir do mesmo experimento. Este protocolo pode ser usado não só para estudar anticorpos, mas também para medir fortes ligações proteína-proteína para proteínas com uma massa molecular maior que 50 kilodaltons. Comece usando fórceps de ponta macia e lave garrafas para enxaguar sequencialmente 24 por 50 milímetros de coberturas de cima a baixo com água destilada, etanol, água destilada, isopropanol e água destilada.
Após a última lavagem, seque as tampas com um fluxo de nitrogênio limpo na mesma direção para evitar a transferência de contaminação dos fórceps. Enxágüe 24 por 24 milímetros com água destilada e etanol como demonstrado, seguido de secagem com um fluxo de nitrogênio limpo. Após a secagem, coloque uma tampa de 24 por 24 milímetros sobre um pedaço de papel alumínio e coloque tiras de fita dupla face no deslizamento de tampas.
Em seguida, corte o deslizamento de cobertura de 24 por 24 milímetros para fora da folha e pressione suavemente a folha para o lado de trabalho do deslizamento de cobertura de 24 por 50 milímetros. Para preparar amostras de anticorpos-antígenos para as medidas de afinidade, filtre pelo menos dois mililitros de PBS através de um filtro de seringa de 0,22 mícrons para remover partículas e agregados de poeira, e centrifugar os estoques de anticorpos e antígenos de interesse. Meça a absorção UV de 280 nanômetros dos estoques de anticorpos e antígenos para determinar suas concentrações reais, e prepare uma série de misturas de anticorpos e antígenos na faixa apropriada de concentrações de antígeno em um volume final de 50 microliters por amostra.
Em seguida, incubar as misturas de anticorpos de antígeno por aproximadamente 10 minutos à temperatura ambiente para permitir que a reação de ligação atinja o equilíbrio químico. Para avaliar a afinidade anticorpo-antígeno por fotometria em massa, aplique uma gota de óleo de imersão de microscópio ao objetivo do instrumento e coloque a câmara de fluxo no estágio do microscópio. Adicione 10 microliters de PBS filtrado a uma extremidade do canal da câmara de fluxo.
O buffer entrará no canal por ação capilar. Na guia de controle de foco do software de coleta de dados, use os botões de movimento de estágio grosseiro para cima e para baixo para fazer os ajustes iniciais e clicar em nitidez para ver a leitura do sinal de nitidez. Use os botões de ajuste finos para cima e para baixo para maximizar o valor de nitidez e clique em definir foco e foco de bloqueio para ativar a função de rastreamento de foco.
Uma imagem de um slide limpo deve ter um valor de sinal igual ou inferior a 0,05% Carregar 20 microliters da primeira amostra de anticorpos-antígenos como demonstrado, manchando o líquido da outra extremidade com um pequeno pedaço de papel manchador. Imediatamente após o carregamento, clique em gravar para adquirir o número apropriado de quadros equivalente a 100 segundos de dados. No final do período de coleta de dados, digite um nome de arquivo para os dados e clique em OK e, em seguida, amostra para salvar o arquivo.
Para analisar os dados de fotometria em massa, abra o arquivo de interesse e clique em analisar. Clique em carregar a função de calibração e clique em arquivo e salve resultados para salvar os dados analisados. Para obter as concentrações relativas de cada espécie na amostra, abra os eventos adaptados.
arquivo csv, copie os dados na coluna M no software de plotagem e análise apropriado e use a função histograma de estatísticas de plotagem para traçar a distribuição de massa molecular. Clique duas vezes no histograma para abrir a janela de propriedades do lote, desativar o binning automático e selecionar um tamanho de caixa de 2,5 kilodaltons. Para criar os bin centers e os dados da contagem, clique em aplicar e ir.
Para encaixar o histograma com as funções gaussianas, selecione os centros de lixo e as colunas de contagem e clique nos picos de análise e na função de menu de ajuste de pico múltiplo da linha de base. Clique duas vezes para indicar as posições de pico aproximadas no gráfico de distribuição e clique em abrir o AJUSTE NL. Verifique as caixas de seleção fixas para os centros de pico XC e defina seus valores para as massas moleculares esperadas do anticorpo livre e dos complexos de anticorpos de antígeno único e duplo.
Verifique a opção de compartilhamento para os parâmetros de largura e clique em encaixar. Os valores de altura máxima dos componentes gaussianos representam a concentração relativa de cada espécie na amostra. Em seguida, use a equação para calcular a fração de concentração de cada espécie a partir dos valores de altura máxima.
Para calcular as constantes de equilíbrio usando um programa de planilha, abra o cálculo de dissociação. planilha xlsx. Nesta planilha, os valores de células destacadas amarelas nas linhas 1 a 10 podem ser modificados para realizar os cálculos constantes de equilíbrio.
Digite os valores constantes de dissociação estimados em unidades nanomolares nas células B1 e B2. Se os valores constantes de dissociação estimados não forem conhecidos, deixe os valores padrão nas células B1 e B2 inalterados. Insira o total de anticorpos e concentrações totais de antígeno em unidades nanomolares nas células D2 e E2 e insira os valores de fração calculados para cada espécie nas células F2, G2 e H2. Ao realizar a análise global da titulação, adicione os valores de fração de dados apropriados nas linhas 2 a 10. Na janela de parâmetros do solucionador, selecione a célula B15 para a caixa objetiva definida e as células B1 a B2 para a caixa de células variáveis.
Selecione o botão min para a opção a to e verifique a caixa de seleção de variáveis não-negativas, selecione GRG não linear como o método de resolução e clique em resolver. Os valores constantes de dissociação mais adequados serão mostrados nas células B1 e B2. E a soma final dos erros quadrados será mostrada na célula B15. Neste experimento representativo, uma série de titulação com o anticorpo trombina anti-humana em uma concentração fixa de 25 nanomolares e 0, 7,5, 15, 30, 60 e 120 concentrações de alfa-trombina humana nanomolar foram realizadas para obter as distribuições moleculares de massa das misturas de anticorpos de antígeno e apenas anticorpos.
Os parâmetros de altura máxima mais adequados dos componentes gaussianos foram normalizados para obter frações de concentração de espécies. Os valores da fração de concentração foram então adequados globalmente para obter as afinidades de ligação antígeno-anticorpo. As frações de concentração experimental e os resultados globais de ajuste para o anticorpo livre, complexo de anticorpos monogênicos e complexo de antígeno duplo poderiam então ser plotados.
Para obter valores de KD precisos, as concentrações proteicas devem ser cuidadosamente selecionadas para povoar todas as espécies de reação. Recomendamos preparar uma série de titulação usando uma série de concentrações de antígeno. Após a montagem dos dados, o método de projeção de erro pode ser usado para obter o erro de montagem, mas é melhor repetir o experimento e calcular os desvios padrão dos valores médios de afinidade de ligação.
