Este protocolo permite desarrollar andamios vascularizados utilizando riñones en un modelo de rata. El riñón es el órgano más adecuado para andamios de células madre diferenciadas. Este es un protocolo altamente exitoso para la descelularización del riñón.
Elimina eficazmente los núcleos con una destrucción mínima de la ultraestructura ecm. Esta técnica se puede aplicar a la medicina del trasplante y a la ingeniería de tejidos. Demostrando el procedimiento estará Kim Joo Hyoung, un MD / PhD profesor asociado de cirugía plástica de mi laboratorio.
Para comenzar, coloque la rata Sprague Dawley de ocho semanas de edad en una almohadilla de calentamiento y coloque una sonda de termómetro rectal en el recto para monitorear la temperatura central. Después de anestesiar a la rata, colóquela en una posición supina y asegure las cuatro extremidades a la mesa con cinta adhesiva. Afeitarse y limpiar el abdomen con jabón germicida.
Aplique 2% betadina durante al menos uno o dos minutos, luego límpiela con una solución de etanol al 70%. Repita esta secuencia tres veces. Cubra el campo operativo con una cortina estéril y fenestrada.
Haga una incisión abdominal vertical y exponga el riñón izquierdo, el uréter, la aorta abdominal y la vena cava inferior. Diseccione el tejido justo antes de cortar el pedículo. Prepare 50 mililitros de solución de perfusión por rata mezclando PBS con aproximadamente 10 unidades por mililitro de heparina.
Mezcle volúmenes iguales de 8% PFA con PBS para hacer la solución 4% PFA. Extienda la incisión abdominal vertical cranealmente, asegurándose de alejar las tijeras de los órganos al cortar para evitar daños. Continúe la incisión a través de la caja torácica y luego corte el diafragma levantando el esternón.
Retraiga el colgajo suelto de piel fuera del camino con una abrazadera Allis, y libere el corazón rasgando cualquier tejido conectivo con el fórceps. Abra la línea de PBS y asegúrese de que esté fluyendo antes de colocar la aguja en el ventrículo izquierdo. Sostenga el corazón suavemente con las medidas de control contundentes y use un hemóstato para controlar la aguja.
La aguja debe insertarse no más de un cuarto de pulgada. Mientras apoya el corazón con la aguja y el hemóstato, localice la aurícula derecha y snip a través de ella con tijeras de iridectomía. Descanse el hemóstato en el cuerpo de la rata y asegúrese de que la aguja todavía esté colocada dentro del corazón.
Continúe perfundiendo PBS durante cuatro minutos o más si todavía hay sangre visible en el riñón y el hígado. Cosechar el riñón izquierdo con la aorta abdominal y la vena cava inferior. Ligate el uréter, la aorta torácica, la vena cava superior, y las ramas de la aorta abdominal.
Mantenga el órgano hidratado en DPBS en una placa de Petri de 10 centímetros. Cannulate la aorta abdominal y la vena cava inferior con un catéter de la galga 23. Para eliminar la sangre residual, conecte la cánula con una bomba peristáltica y lave el órgano con 500 mililitros de DPBS y 16 unidades por mililitro de heparina durante 90 minutos a cinco rpm y 37 grados Celsius.
Para descelularizar el riñón, perfundirlo con 1%Triton X-100 durante tres horas y luego con una solución 0.75%SDS durante seis horas a una presión constante de 40 mililitros de mercurio. Para eliminar la SDS residual, perfunda la muestra con penicilina al 1% en agua destilada durante 18 horas y luego con DPBS estéril y 16 unidades por mililitro de heparina durante 90 minutos. La morfología gruesa de los riñones de la rata era roja oscura.
Después de la descelularización, el riñón se volvió pálido y translúcido. El ADN genómico residual se cuantificó en andamios renales descelularizados y se comparó con el de los riñones nativos, lo que confirma que el ADN genómico tisular casi se eliminó después de la descelularización. A partir de 14 casos, el contenido medio de la DNA era 115,05 nanogramos por microlitro para el control y 1,96 nanogramos por microlitro para el andamio descelularizado.
En total, se eliminó el 98,3% del ADN. La estructura tridimensional fue mantenida, y los glomérulos acelulares fueron preservados en la parenquimia cortical. Al insertar la aguja en el ventrículo izquierdo, se debe insertar no más de un cuarto de pulgada.
Cualquier inserción posterior puede salir del otro lado. Confiamos en que esta técnica abrirá una nueva perspectiva en el campo de la ingeniería de tejidos.
