Préparation d’échafaudages rénaux décellulaires chez le rat

Ce protocole permet de développer des échafaudages vascularisés à l’aide de reins dans un modèle de rat. Le rein est l’organe le plus approprié pour les échafaudages de cellules souches différenciées. C’est un protocole très réussi pour la décellularisation du rein.

Il élimine efficacement les noyaux avec une destruction minimale de l’ultrastructure ECM. Cette technique peut être appliquée à la médecine de transplantation et à l’ingénierie tissulaire. Kim Joo Hyoung, professeur agrégé de chirurgie plastique de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.

Pour commencer, placez le rat Sprague Dawley âgé de huit semaines sur un coussin chauffant et placez une sonde thermométrique rectale dans le rectum pour surveiller la température centrale. Après avoir anesthésié le rat, placez-le en décubitus dorsal et fixez les quatre membres à la table avec du ruban adhésif. Rasez et nettoyez l’abdomen avec du savon germicide.

Appliquez 2% de bétadine pendant au moins une à deux minutes, puis essuyez-la avec une solution d’éthanol à 70%. Répétez cette séquence trois fois. Couvrez le champ opératoire avec un drapé stérile et fenêtré.

Faites une incision abdominale verticale et exposez le rein gauche, l’uretère, l’aorte abdominale et la veine cave inférieure. Disséquer le tissu juste avant de couper le pédicule. Préparer 50 millilitres de solution de perfusion par rat en mélangeant du PBS avec environ 10 unités par millilitre d’héparine.

Mélanger des volumes égaux de 8% PFA avec PBS pour faire la solution 4% PFA. Étendre l’incision abdominale verticale de manière crânienne, en vous assurant de retirer les ciseaux des organes lors de la coupe pour éviter tout dommage. Continuez l’incision à travers la cage thoracique, puis coupez à travers le diaphragme en soulevant le sternum.

Rétractez le lambeau lâche de la peau à l’écart avec une pince Allis et libérez le cœur en déchirant tout tissu conjonctif avec la pince. Ouvrez la ligne PBS et assurez-vous qu’elle coule avant de placer l’aiguille dans le ventricule gauche. Tenez doucement le cœur avec une pince émoussée et utilisez un hémostatique pour contrôler l’aiguille.

L’aiguille ne doit pas être insérée plus d’un quart de pouce. Tout en soutenant le cœur avec l’aiguille et l’hémostatique, localisez l’oreillette droite et passez-y un coup de ciseaux iridectomy. Reposez l’hémostatique sur le corps du rat et assurez-vous que l’aiguille est toujours positionnée à l’intérieur du cœur.

Continuer à perfuser le PBS pendant quatre minutes ou plus s’il y a encore du sang visible dans les reins et le foie. Récoltez le rein gauche avec l’aorte abdominale et la veine cave inférieure. Ligate l’uretère, l’aorte thoracique, la veine cave supérieure, et les branches de l’aorte abdominale.

Gardez l’organe hydraté dans le DPBS dans une boîte de Petri de 10 centimètres. Canule l’aorte abdominale et la veine cave inférieure avec un cathéter de calibre 23. Pour enlever le sang résiduel, connectez la canule avec une pompe péristaltique et lavez l’organe avec 500 millilitres de DPBS et 16 unités par millilitre d’héparine pendant 90 minutes à cinq tours et 37 degrés Celsius.

Pour décellulariser le rein, perfuser avec 1% Triton X-100 pendant trois heures, puis avec une solution SDS à 0,75% pendant six heures à une pression constante de 40 millilitres de mercure. Pour éliminer les FDS résiduelles, perfuser l’échantillon avec 1 % de pénicilline dans de l’eau distillée pendant 18 heures, puis avec du DPBS stérile et 16 unités par millilitre d’héparine pendant 90 minutes. La morphologie brute des reins de rat était rouge foncé.

Après la décellularisation, le rein est devenu pâle et translucide. L’ADN génomique résiduel a été quantifié dans des échafaudages rénaux décellulaires et comparé à celui dans les reins natifs, confirmant que l’ADN génomique tissulaire a été presque éliminé après la décellularisation. Sur 14 cas, les teneurs moyennes en ADN étaient de 115,05 nanogrammes par microlitre pour le témoin et de 1,96 nanogramme par microlitre pour l’échafaudage décellulaire.

Au total, 98,3 % de l’ADN a été prélevé. La structure tridimensionnelle a été maintenue, et des glomérules acellulaires ont été préservés dans le parenchyme cortical. Lors de l’insertion de l’aiguille dans le ventricule gauche, elle ne doit pas être insérée plus d’un quart de pouce.

Toute autre insertion peut sortir de l’autre côté. Nous sommes convaincus que cette technique ouvrira une nouvelle perspective dans le domaine de l’ingénierie tissulaire.