Preparazione di impalcature renali decellularizzate nei ratti

Questo protocollo consente di sviluppare impalcature vascolarizzate utilizzando reni in un modello di ratto. Il rene è l'organo più adatto per impalcature di cellule staminali differenziate. Questo è un protocollo di grande successo per la decellularizzazione del rene.

Rimuove efficacemente i nuclei con la minima distruzione dell'ultrastruttura ECM. Questa tecnica può essere applicata alla medicina dei trapianti e all'ingegneria tissutale. A dimostrare la procedura sarà Kim Joo Hyoung, professore associato di chirurgia plastica del mio laboratorio.

Per iniziare, posizionare il ratto Sprague Dawley di otto settimane su un tampone riscaldante e posizionare una sonda termometro rettale nel retto per monitorare la temperatura interna. Dopo aver anestetizzato il topo, posizionarlo in posizione supina e fissare i quattro arti al tavolo con del nastro adesivo. Radere e pulire l'addome con sapone germicida.

Applicare il 2%Betadine per almeno uno o due minuti, quindi pulirlo con una soluzione di etanolo al 70%. Ripetere questa sequenza tre volte. Coprire il campo operatorio con un drappo sterile e fenestrato.

Fai un'incisione addominale verticale ed esponi il rene sinistro, l'utere, l'aorta addominale e la vena cava inferiore. Sezionare il tessuto poco prima di tagliare il pedicolo. Preparare 50 millilitri di soluzione perfusione per ratto mescolando PBS con circa 10 unità per millilitro eparina.

Mescola volumi uguali dell'8%PFA con PBS per creare la soluzione PFA al 4%. Estendere l'incisione addominale verticale cranicamente, assicurandosi di disegnare le forbici lontano dagli organi durante il taglio per evitare danni. Continuare l'incisione attraverso la gabbia toracica, quindi tagliare attraverso il diaframma sollevando lo sterno.

Ritrai il lembo sciolto della pelle con un morsetto Allis e libera il cuore strappando qualsiasi tessuto connettivo con le pinze. Aprire la linea PBS e assicurarsi che fluisco prima di posizionare l'ago nel ventricolo sinistro. Tenere delicatamente il cuore con pini smussati e utilizzare un emostato per controllare l'ago.

L'ago deve essere inserito non più di un quarto di pollice. Mentre si sostiene il cuore con l'ago e l'emostato, individuare l'atrio destro e tagliarlo attraverso di esso con forbici per iridectomia. Appoggia l'emostato sul corpo del topo e assicurati che l'ago sia ancora posizionato all'interno del cuore.

Continuare a perfondere PBS per quattro minuti o più se c'è ancora sangue visibile nel rene e nel fegato. Raccogliere il rene sinistro con l'aorta addominale e la vena cava inferiore. Ligate l'urigatore, l'aorta toracica, la vena cava superiore e i rami dell'aorta addominale.

Mantenere l'organo idratato in DPBS in una piastra di Petri di 10 centimetri. Cannulate l'aorta addominale e la vena cava inferiore con un catetere calibro 23. Per rimuovere il sangue residuo, collegare la cannula con una pompa peristaltica e lavare l'organo con 500 millilitri di DPBS e 16 unità per millilitro eparina per 90 minuti a cinque giri/min e 37 gradi Celsius.

Per decellularizzare il rene, perfonderlo con 1%Triton X-100 per tre ore e quindi con una soluzione di SDS dello 0,75% per sei ore a una pressione costante di 40 millilitri di mercurio. Per rimuovere l'SDS residuo, perfondere il campione con 1%penicillina in acqua distillata per 18 ore e quindi con DPBS sterile e 16 unità per millilitro eparina per 90 minuti. La morfologia grossolana dei reni del ratto era rosso scuro.

Dopo la decellularizzazione, il rene divenne pallido e traslucido. Il DNA genomico residuo è stato quantificato in impalcature renali decellularizzate e confrontato con quello dei reni nativi, confermando che il DNA genomico tissutale è stato quasi eliminato dopo la decellularizzazione. Da 14 casi, il contenuto medio di DNA era di 115,05 nanogrammi per microlitro per il controllo e 1,96 nanogrammi per microlitro per l'impalcatura decellularizzata.

In totale, il 98,3% del DNA è stato rimosso. La struttura tridimensionale fu mantenuta, e i glomeruli acellulari furono conservati nel parenchima corticale. Quando si inserisce l'ago nel ventricolo sinistro, deve essere inserito non più di un quarto di pollice.

Qualsiasi ulteriore inserimento può uscire dall'altra parte. Siamo confidiamo che questa tecnica aprirà una nuova prospettiva nel campo dell'ingegneria tissutale.