ラットにおける脱細胞化腎臓足場の調製

このプロトコルは、ラットモデルで腎臓を用いた血管化足場の開発を可能にする。腎臓は分化した幹細胞の足場に最も適した器官である。これは、腎臓の脱細胞化のための非常に成功したプロトコルです。

それは効果的にECMの超構造の最低の破壊と核を除去する。この技術は移植医学および組織工学に適用することができる。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の整形外科のMD/博士准教授キム・ジュヨンです。

まず、生後8週間のスプレイグ・ドーリーラットを温暖化パッドに置き、直腸温度計プローブを直腸に置いてコア温度を監視します。ラットを麻酔した後、それをスピービンの位置に置き、4つの手足をテープでテーブルに固定します。殺菌石鹸で腹部を剃り、きれいにします。

2%ベタジンを少なくとも1〜2分間塗布し、70%エタノール溶液で拭き取ります。このシーケンスを 3 回繰り返します。滅菌、フェネストドレープで手術場をカバーします。

垂直腹部切開を行い、左腎臓、尿管、腹部大動脈、および下の大静脈を露出させる。ペディクルを切断する直前に組織を解剖する。1ミリリットルヘパリンあたり約10単位でPBSを混合することにより、ラット当たり50ミリリットルの灌流溶液を調製する。

4%PFA ソリューションを作成するには、PBS と 8%PFA の等量を混合します。垂直腹部切開をクラニカルに伸ばし、損傷を避けるために切断するときにはさみを臓器から引き離すことを確認します。リブケージを通して切開を続け、胸骨を持ち上げて横隔膜を切り裂く。

アリスクランプで皮膚の緩いフラップを引き込み、鉗子で結合組織を引き裂くことによって心臓を解放する。PBSラインを開き、針を左心室に入れる前に流れていることを確認します。鈍い鉗子で心臓を優しく保持し、針を制御するために止止めを使用します。

針は4分の1インチ以下に挿入する必要があります。針と止止めで心臓を支えながら、右心房を見つけ、虹色の十二次はさみでそれを切り取ります。ラットの体に止まりを置き、針がまだ心臓の内側に配置されていることを確認します。

腎臓と肝臓にまだ血液が見える場合は、4分以上PBSを浸透させ続けます。腹部大動脈と下の大静脈で左腎臓を収穫する。尿管、胸部大動脈、上大静脈、および腹部大動脈の枝をリゲートする。

臓器をDPBSで10センチメートルのペトリ皿に水分補給してください。23ゲージのカテーテルで腹部大動脈と下の大静脈をカヌレートする。残留血液を除去するには、カニューレを蠕動ポンプで接続し、5rpmと37°Cで90分間、DPBSと16単位のDPBSと16単位で臓器を洗浄します。

腎臓を脱細胞化するには、1%Triton X-100を3時間浸透させ、0.75%SDS溶液を40ミリリットルの水銀の一定圧力で6時間浸透させます。残留SDSを除去するには、蒸留水中に1%ペニシリンを1%ペニシリンで18時間浸透させ、滅菌DPBSと1ミリリットルヘパリンあたり16単位で90分間浸透させます。ラット腎臓の総形態は濃赤色であった。

脱細胞化後、腎臓は青白く半透明になった。残存ゲノムDNAは、脱細胞化された腎臓足場で定量化され、ネイティブの腎臓と比較して、組織ゲノムDNAが脱細胞化後にほぼ排除されたことを確認した。14例から、対照の場合はマイクロリットル当たり115.05ナノグラム、脱細胞化足場ではマイクロリットル当たり1.96ナノグラムであった。

合計で、DNAの98.3%が除去された。3次元構造を維持し、細胞球体は皮質のパレンチマに保存した。左心室に針を挿入する場合、それは4分の1インチ以下を挿入する必要があります。

これ以上の挿入は、反対側に出てくることがあります。私たちは、この技術が組織工学の分野で新たな見通しを開くと確信しています。