M.Z. e K.S.F. e este trabalho foi apoiado por uma bolsa concedida sob o Pitt Innovation Challenge (PInCh), através do Instituto de Ciência Clínica e Translacional da Universidade de Pittsburgh, e bolsa NHLBI R01 HL153407, concedida ao M.Z.

O Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Pittsburgh aprovou todos os protocolos de animais especificados nesta publicação antes de realizar qualquer um desses experimentos em animais.
NOTA: Este protocolo detalha como realizar estudos de liberação mucociliary in vivo utilizando imagens de radionuclídeos com um scanner SPECT/CT de dupla modalidade. As técnicas demonstradas são calibrações do sistema, camundongos anestesiantes, intubação traqueal de camundongos, instilação do isótopo nos pulmões, imagem de dupla modalidade, co-registro dessas imagens e análise.
1. Configuração do sistema SPECT/CT
<ol><li>Projete um fluxo de trabalho apropriado e configure antes de executar experimentos usando animais vivos.<ol>
<li>Use uma aquisição SPECT consistindo de 60 projeções com um tamanho de passo de 6o entre projeções com um raio de rotação de 40 cm. A aquisição do CT consiste em 220 projeções com ângulo de 1,6o entre as projeções.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Certifique-se de que o sistema tenha os collimadores MWB corretos para ratos e imagens SPECT no lugar. Se os collimadores inadequados forem instalados, use o assistente do colisador para instalar os corretos.</li>
	<li>Execute as calibrações necessárias do sistema para preparar o sistema para uso. NOTA: Os componentes SPECT e CT do scanner precisam de calibração. Calibrar os componentes ct usando um condicionamento de origem e uma calibragem escura/clara (D/L) uma vez por dia, uma calibração de Deslocamento central (COS) a cada 2 semanas e avaliar o hardware de raio-x todos os meses. Os componentes SPECT precisam ser calibrados uma vez por ano.<ol>
<li>Para avaliar o hardware do raio-x, verifique a caixa de hardware de raios-X durante as calibrações da tomografia computadorizada (Menu de Calibração da tomografia suplementar).</li>
		<li>Para realizar o condicionamento de origem, verifique a caixa de condicionamento de origem durante as calibrações da ct(Menu de Calibração do CT Suplementar).</li>
		<li>Para realizar uma calibração D/L, verifique a caixa D/L ao lado do protocolo de aquisição de CT usado durante os experimentos durante as calibrações de tomografia computadorizada. Desmarcar todos os outros protocolos(Menu de Calibração de CT Suplementar).</li>
		<li>Para realizar uma calibração cos, substitua a cama pela ferramenta de anel de calibração, ajuste as configurações do tipo de cama para combinar nas configurações de controle de movimento e verifique a caixa COS ao lado do protocolo de aquisição de CT usado durante os experimentos durante as calibrações da tomografia computadorizada. Desmarcar todos os outros protocolos(Menu de Calibração de CT Suplementar, Anel de Calibração Suplementar).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Intubação e Instilação do Rato
<ol><li>Pesar os ratos para serem escaneados. Se escanear vários camundongos, tome cuidado para marcar os ratos para fins de identificação usando métodos como perfuração de orelha ou marcação da cauda.</li>
	<li>Anestesia um rato usando isoflurano de 1,5% com um fluxo de gás de 2 L/min O2 em uma câmara de gás por ~5 minutos para produzir anestesia de profundidade suficiente, até que a respiração desacelere para ~55-65 respirações por minuto 16 (Figura 1A).</li>
	<li>Retire o mouse da câmara e suspenda pelos incisivos dianteiros em uma entubação em uma inclinação de 45o. Equipar o suporte de intubação com um cone de nariz para garantir que o mouse seja anestesiado durante a intubação (Figura 1B).</li>
	<li>Conecte uma extremidade de um fio de fibra óptica de 50 μm a uma fonte de luz e enfie uma cânula de 20 bitola sobre ele usando o fio para agir como guia(Figura 1C).</li>
	<li>Abra a boca do mouse e puxe a língua para a frente usando fórceps contundentes. Ilumine o fio-guia e use-o para visualizar as cordas vocais(Figura 1D).</li>
	<li>Passe o fio guia através das cordas vocais para que o fio esteja um pouco além das cordas vocais e descansando na traqueia superior. Deslize a cânula de 1 polegada para a frente ao longo do fio para entubar o rato, passando a cânula profunda o suficiente para que o cubo dele seja contra os incisivos do animal(Figura 1E). Remova o fio deixando a cânula no lugar.</li>
	<li>Teste a intubação conectando brevemente a cânula com um dedo e verificando se há alterações na respiração. Respiração interrompida ou respiração tensa enquanto conecta e respiração acelerada após a liberação são sinais de intubação traqueal adequada. Se não houver alteração nos padrões respiratórios ao ligar a cânula, este último é provável no esôfago.</li>
	<li>Prepare 0,2 mCi de 99mtecnezium-sulfur colloid(99mTc-Sc) em um volume de 10 μL, e pipeta na cânula. Permita que o rato inale espontaneamente nos pulmões por mais de 1-2 min (Figura 1F). Remova a cânula antes de transferir o mouse para a paleta do scanner. NOTA: O radionuclídeo foi preparado e filtrado pelo Cardeal Health.</li>
</ol>3. Imagem SPECT/CT
<ol><li>Transfira o mouse para uma paleta de 25 mm com um cone de nariz e fixe com fita adesiva, tomando cuidado para não prender o peito e o abdômen muito fortemente para evitar prejudicar a respiração. Tome cuidado para remover quaisquer etiquetas de ouvido de metal ligadas ao mouse.</li>
	<li>Prepare um fantasma radioativo composto por 0,05 mCi em 200 μL e coloque essa quantidade em um tubo PCR de 0,2 mL. Posicione o tubo gravando a palete sob o abdômen inferior do mouse, evitando a sobreposição com os pulmões. NOTA: O fantasma é usado com o propósito de co-registrar imagens CT e SPECT, bem como um controle negativo para liberação.</li>
	<li>Insira o mouse no sistema SPECT/CT, selecione o fluxo de trabalho de imagem e execute a configuração.</li>
	<li>Configure o posicionamento dos detectores no mouse e execute o fluxo de trabalho de imagem.</li>
	<li>Prepare uma gaiola para camundongos que receberam radioatividade pós-procedimento, com acesso irrestrito a alimentos e água, e rotulagem clara usando um adesivo de segurança de radiação.</li>
	<li>Após a conclusão do fluxo de trabalho, remova o mouse da paleta de imagens e permita que ele se recupere na gaiola preparada por uma duração de 6 horas entre as varreduras (fim da varredura 1 até o início da varredura 2) com acesso a ad libitum a alimentos e água. 6 h foi escolhido, pois corresponde ao período de tempo em que o desembaraço linear dependendo da função cília está ocorrendo com muito pouca folga alveolar.</li>
	<li>Após 6 horas, reestimule o mouse e escaneie, juntamente com o fantasma, usando o mesmo fluxo de trabalho para medir a quantidade de isótopo retirado das vias aéreas. NOTA: É fundamental permitir que o rato se recupere como anestesia ininterrupta com isoflurano por 6 horas levará a um efeito cilia-depressivo significativo, resultando em desobstruções mucociliais próximas de zero.</li>
</ol>4. Análise
<ol><li>Após a imagem, realize o pós-processamento para reconstruir imagens completas de pilha 3D.<ol>
<li>Histograma as imagens SPECT usando as configurações padrão de fábrica para 99mTc e, em seguida, reconstruir usando um algoritmo MAP3D e reconstrução da função de propagação de ponto (PSF). NOTA: A reconstrução foi realizada utilizando-se 8 iterações e 6 subconjuntos. Uma reconstrução eficaz precisa de uma proporção de subconjuntos para projeções em 1:10 ou dividir uniformemente o número de projeções, de modo que 6 subconjuntos foram usados devido à aquisição usando 60 projeções.</li>
		<li>Reconstrua as imagens ct usando o algoritmo Feldkamp e um filtro Shepp-Logan. NOTA: A reconstrução foi realizada por meio de 4 iterações.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Processe as imagens CT e SPECT em FIJI ImageJ21 usando a ferramenta reslice para gerar imagens de visualização coronal a partir das imagens axiais padrão. Em seguida, execute uma projeção de soma de pilha de z na imagem SPECT para adicionar os dados de contagem de cada fatia e gerar uma única imagem para facilitar a análise.</li>
	<li>Redimensione e co-registre as imagens CT e SPECT utilizando o tubo Eppendorf fantasma como referência (Figura 2A,B). Rastreie e use medições consistentes de redimensionar em todas as amostras.</li>
	<li>Binarize a imagem ct usando limiar automático, seguido de inverter a pilha, e realizar uma projeção de soma de pilha de z para gerar um contorno dos pulmões para análise(Figura 2C).</li>
	<li>Gire as imagens CT e SPECT e mescle a imagem usando as ferramentas de canal. Calcule o MCC desenhando um ROI ao redor do pulmão direito e medindo(Figura 2D). NOTA: Esta medição será da contagem total no pulmão direito para os pontos de tempo de 0 e 6 horas, com as imagens de 6 horas corrigidas para decomposição radioativa usando a fórmula: N(t) = N0e−t. 99m Tc-Sc tem uma constante de decadência de 3,21e−5 por segundo com uma meia-vida de ~6 horas. Esses valores podem então ser usados para calcular uma autorização por cento. NOTA: O pulmão direito é escolhido para o desenho do ROI e a medição conta, pois a liberação mucociliaria transportará o radioisótopo para fora dos pulmões para a faringe de onde será engolido e acabará no estômago. Com bastante frequência, as contagens podem ser vistas no estômago que podem se sobrepor com o pulmão esquerdo e, portanto, produzir contagens errôneas. Essa confusão pode ser evitada medindo apenas as contagens no pulmão direito.</li>
</ol>

<ol>
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Nenhum relacionado a este trabalho.

O papel da cília respiratória motil tanto na doença quanto no desenvolvimento continua a evoluir e ser melhor apreciado. Batida síncrono e metachronal de cílios motile múltiplos na superfície apical das células que revestem a árvore traqueobronquial geram fluxo de cefalávia produzindo liberação mucociliaria ou MCC. O CCM está comprometido em ciliopatias como a PCD22, doenças adquiridas como a DPOC18,e sua importância está sendo reconhecida em CHDs, não tradicionalmente consideradas ciliopatias. Dados recentes mostraram disfunção ciliar respiratória tanto em CHD com heterotaxia23 quanto sem heterotaxia7. Tal disfunção motil cilia mostrou-se traduzida em maiores sintomas respiratórios9, bem como maior morbidade pós-operatória8. A maioria, se não todas, dessas doenças, tem modelos de mouse disponíveis e nosso protocolo para medir o MCC em camundongos é uma ferramenta valiosa que pode ser utilizada para testar potenciais terapêuticas.
Os modelos animais fornecem utilidade para a compreensão das doenças e o desenvolvimento de terapias. A imagem animal in vivo fornece mais utilidade com a capacidade de adquirir múltiplos pontos de dados dos mesmos animais, sem a necessidade de sacrificar os animais, permitindo que os pesquisadores sigam o curso longitudinal da doença, bem como a duração do estudo dos efeitos do tratamento. O modelo de camundongos do MCC foi desenvolvido ao longo de décadas por vários investigadores, sendo inicialmente realizado em cães de beagle usando scintigrafia planar, uma técnica de imagem nuclear bidimensional24. A técnica foi adaptada para uso em camundongos uma década depois, seguida de adaptação à imagem SPECT uma décadadepois, 25,26. O desenvolvimento dessa técnica em modelos de camundongos foi um grande desenvolvimento na relevância dessa técnica, devido à disponibilidade de múltiplos modelos de camundongos de doenças humanas como a PCD em que a função ciliar é significativamente alterada. O MCC foi avaliado em modelos de camundongos de denervação pulmonar e imunossupressão, e tem potencial para ser usado em conjunto com outros modelos19,26. Estudos de medição de CCM em pacientes humanos com doenças das vias aéreas como CF, asma, PCD e ciliopatias associadas à CSP têm sido realizados, e têm dado resultados que a técnica pode auxiliar tanto estudos de fisiologia pulmonar quanto eficácia terapêutica13.
Uma parte importante deste protocolo é a criação de aquisições com os parâmetros corretos de imagem para adquirir imagens precisas para quantificação. Uma série de fatores são fundamentais ao projetar as configurações de aquisição do SPECT, incluindo quais collimadores são usados, o número de projeções para adquirir por revolução e o tamanho da etapa de rotação. A seleção de collimadores é um fator importante na sensibilidade e resolução da aquisição, e as configurações de aquisição podem precisar ser adaptadas ao collimador que está sendo utilizado27. Alternativamente, ao usar animais maiores como ratos, os collimadores precisariam ser ajustados. Vários collimadores de pinhole, por exemplo, são mais sensíveis, mas deve-se tomar cuidado ao selecionar um tamanho de etapa para evitar projeções sobrepostas e causar multiplexing indesejado, o que pode aumentar ainda mais a sensibilidade da aquisição em detrimento de alguma ambiguidade de imagem que pode causar artefatos de reconstrução25. A configuração de reconstrução também é fundamental para gerar imagens quantificáveis. MAP3D é um algoritmo de reconstrução iterativo comumente usado, e PSF é um modelo de reconstrução comum. Ambos são confiáveis para a reconstrução de imagens, mas deve-se tomar cuidado ao definir o número de iterações e subconjuntos. Um maior número de iterações aumentará o tempo computacional necessário para a reconstrução, e aumentará a qualidade da reconstrução com retornos reduzidos após um aumento adicional.
Para quantificar imagens no ImageJ, a ferramenta de medição ideal para usar é rawintden, que produz o valor da soma dos pixels em uma seleção. Ao quantificar os dados SPECT em ROIs pulmonares de tamanho diferente, o uso do RawIntDen fornece uma medida absoluta de contagens e evita ajustar a medição à área do ROI, como a medição média seria21.
Esta técnica tem uma série de fontes de erro associadas que o investigador deve estar ciente ao aplicar esta técnica. Um notáveis confundimento é o uso de agentes anestésicos. Isoflurane é um anestésico de ação rápida e inalado que os ratos se recuperam rapidamente após a conclusão de uma aquisição. No entanto, deve-se tomar cuidado para fornecer aos camundongos tempo suficiente para se recuperarem em suas gaiolas, e não mantidos anestesiados por mais tempo do que o necessário. Em nossa experiência pessoal (dados não publicados) os ratos que foram mantidos anestesiados continuamente usando isoflurane inalado entre o ponto de tempo de 0 e 6 horas mostraram folga insignificante. Da mesma forma, uma dose controlada de anestésico também é necessária para garantir uma recuperação rápida. Ao fixar o animal na paleta para imagem, o tubo fantasma usado para co-registro deve ser mantido baixo no estômago para evitar que artefatos se sobreponham com os pulmões. Da mesma forma, para garantir uma imagem ct de qualidade, tome cuidado para remover quaisquer etiquetas metálicas do mouse para evitar artefatos de dispersão de raios-X.
O protocolo MCC atual pode ser aplicado a uma miríade de modelos animais. Essa técnica tem um efeito insignificante sobre a saúde do animal escaneado, é bem tolerada por camundongos, e por isso pode ser usada com modelos de doenças sem arriscar a saúde de camundongos já delicados. A força dessa metodologia vem de ser uma técnica in vivo, que permite a aquisição de medições consistentes e repetíveis da função das vias aéreas sem o sacrifício de animais para extirto de traqueias para video-microscopia, que os modelos ex vivo exigem26. A consistência desta técnica na produção de medições repetíveis em múltiplos escaneamentos dos mesmos animais, permite que o mesmo animal seja tratado com diferentes agentes ou potenciais terapêuticos, e comparações estatísticas feitas entre o mesmo animal para reduzir a variabilidade biológica inerente a qualquer modelo animal, reduzindo assim o tamanho da amostra necessária para apresentar diferenças estatisticamente significativas.
A avaliação da função das vias aéreas utilizando a técnica mcc pode ser ajustada a uma variedade de modelos animais e aplicada a muitos modelos diferentes de saúde das vias aéreas, bem como testar novas terapias. As vias aéreas dos modelos de mouse de PCD podem ser avaliadas usando essa técnica, bem como modelos de DPOC. Nosso método também pode ser utilizado para estudar efeitos diferenciais de vários anestésicos no MCC que estão em uso clínico comum. Por fim, os efeitos dos agentes terapêuticos nas vias aéreas também podem ser avaliados utilizando este modelo. Como dito anteriormente, mas tem repetição, por ser uma medida in vivo, permite repetir avaliações de CCM ao longo de uma doença, bem como testar benefícios de intervenções terapêuticas ao longo do tempo. Além disso, os camundongos são os animais de laboratório mais comuns usados para imitar/estudar doenças humanas, com, em alguns casos, múltiplos modelos de camundongos transgênicos da doença humana disponíveis para escolher.

Cília são organelas celulares baseadas em microtúbulos conservadas ao longo da história evolutiva de algas a humanos. Eles emanam de superfícies celulares e têm uma série de funções1, que vão desde o reconhecimento de sinais sensoriais ambientais locais até a motilidade, funções que podem ser traçadas de volta dos humanos aos primeiros organismos eucarióticos unicelulares2,3. A Cília pode ser não-motile e única servindo como antena especializada de uma célula para processar sinais ambientais; ou motile e múltiplos, batendo em ondas metachronais sincronizadas para gerar fluxo de fluidos, como no revestimento dos tubos falópios e nas vias aéreas superiores e inferiores, exceto pelos brônquios terminais que levam aos alvéolos1,2.
A extensa superfície epitelial do trato respiratório está exposta a uma constante barragem de contaminação na forma de uma variedade de poluentes e patógenos inalados potencialmente perigosos, necessitando de uma defesa. Um dos principais mecanismos de defesa é o aparelho mucociliário da árvore traqueobronquial, onde um fluxo contínuo de muco secreto é transportado mecanicamente para fora das vias aéreas pelo espancamento de múltiplas cílias motile forrando as superfícies apáticas das células epiteliais traqueo-brônquicas. Estas funcionam para prender contaminantes inalados, e através de sua batida contínua e síncrona, transportá-loscefaleia 4,5.
Cilia tem sido demonstrado ter papéis-chave, como no desenvolvimento da padronização esquerda-direita no desenvolvimento de embriões, onde cílios motil na simetria de quebra do nódulo embrionário6. Mutações em genes relacionados à cília têm sido ligadas a doenças como doença cardíaca congênita (DSC) devido à estrutura assimétrica do coração6. Estudos recentes têm relatado alta incidência de disfunção ciliar nos tratos respiratórios de pacientes com ACS, bem como aumento da prevalência de complicações respiratórias pós-operatórias e sintomas do trato respiratório crônico nas vias aéreas superior e inferior7,8,9,10. Pacientes com ACC e disfunção ciliar, com ou sem heterotaxia, têm demonstrado maior risco de complicações respiratórias e desfechos respiratórios negativos pós-operatórios5,8,10. Além de seus papéis na sinalização e desenvolvimento, a importância da cílio das vias aéreas tem sido demonstrada por ciliopatias, das quais um exemplo primordial é a diskinesia ciliar primária (PCD). A PCD é uma doença congênita resultante de uma série de mutações que afetam a cília respiratória motil, levando a infecções pulmonares recorrentes, bronquiectase e potencialmente a necessidade de transplante de pulmão11. Além disso, embora a cília seja normal na fibrose cística (CF), a desordem congênita mais comum na população caucasiana, o CCM é prejudicado devido ao muco grosso e viscoso resultante de mutações no gene CFTR12. Existem vários modelos de mouse de PCD e CF, bem como um número cada vez maior de modelos de CHD. Em última análise, cílios são estruturas versáteis com muitas funções-chave, e um método para avaliar a função da cília respiratória motil in vivo pode ser valioso para o estudo pré-clínico, e avaliar efeitos de mutações, bem como medicamentos no desembaraço mucociliário (MCC)13. O método também seria valioso na avaliação de efeitos de novas drogas, terapia genética ou intervenções no MCC nesses modelos de camundongos.
Existem muitos modelos diferentes que foram usados para avaliar o MCC. Um método notável envolve o uso de corante azul de metileno que foi instilado no brônquio, com folga medida pela medição fibra óptica do movimento do corante14. Este método é limitado pela capacidade de observar o movimento do corante, que é mais rotineiro em humanos do que em modelos pré-clínicos de camundongos. Outro método notável é a imagem de raios-X de contraste de fase síncrotron (PCXI), que pode ser usada para rastrear partículas individuais em uma via aérea. Este método é relativamente novo e não é amplamente acessível15. Existem inúmeros métodos ex vivo de avaliação das vias aéreas, extirparecendo uma traqueia para microscopia por vídeo, porém esses modelos fornecem pouca utilidade em pacientes humanos16. Técnicas de alta resolução para imagens de cílios, como tomografia de coerência óptica, são limitadas da mesma forma17.
Neste artigo, apresentamos um método reprodutível para medir o MCC in vivo que tem sido usado para medir os desembaraços pulmonares em modelos animais miríades, bem como estudar a CCM em doença pulmonar obstrutiva crônica e avaliar os efeitos de medicamentos imunossupressores18,19. Este método rastreia a liberação do radiofarmacêutico 99mtecnezium-sulfur colloid(99mTc-Sc), um radiotracer particulado insolúvel, após instilação nos pulmões. O radionuclídeo pode então ser rastreado usando tomografia computadorizada de emissão de fótons único (SPECT)18,20. Refinamos ainda mais essa técnica para medir o MCC utilizando a dupla modalidade SPECT e a tomografia computadorizada (TC) com co-localização de contagens de radioisótopos para os pulmões e medindo a diminuição dessas contagens ao longo de 6 horas. A imagem de dupla modalidade, com co-registro de imagens de Tomografia Computadorizada e SPECT permite uma localização precisa da contagem de radiação para a nossa região de interesse, os pulmões. Embora descrevamos em detalhes o método de medição de MCC em camundongos, o protocolo pode ser ajustado para estudar MCC em ratos. Os collimadores precisariam ser ajustados, bem como a dose de radiação. Em nossa opinião, os escaneamentos de MCC do rato são mais desafiadores tecnicamente devido ao pequeno tamanho animal, mas mais úteis do que os ratos devido ao grande número de modelos de camundongos estabelecidos de uma série de distúrbios humanos. Além disso, devido ao seu menor custo e custo de manutenção em colônias de animais, um tamanho amostral maior é mais viável em camundongos.

<table><tbody><tr><td>500 &amp;micro;m Unjacketed Fiber Optic Wire</td><td>Edmund Optics</td><td>02-532</td><td></td></tr><tr><td>99mTechnecium-Sulfur Colloid</td><td>Cardinal Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia Vaporizer</td><td>Vetland Medical</td><td>A13480</td><td></td></tr><tr><td>Durmont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>99150-20</td><td></td></tr><tr><td>FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65/1.52p Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Introcan Safety Catheters 20G 1inch</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1534477</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>118-2097</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Intubation Stand</td><td>Kent Scientific</td><td>ETI-MSE-01</td><td></td></tr><tr><td>Siemens Inveon dual-modality SPECT/CT</td><td>Siemens</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single Channel Anesthesia Stand</td><td>Summit Anesthesia Solutions</td><td>22860</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo evaluation of mucociliary clearance in mice

Cilia motile respiratório, organelas especializadas da célula, alinham a superfície apical das células epiteliais que revestem o trato respiratório. Ao bater de forma metachronal, síncrona, essas múltiplas organelas baseadas em actina geram um fluxo de fluido cefálico limpando o trato respiratório de poluentes e patógenos inalados. Com o aumento da poluição ambiental, novos patógenos virais e bactérias emergentes resistentes a múltiplos medicamentos, o desembaraço mucocilial gerado por cílios (CCM) é essencial para a manutenção da saúde pulmonar. O CCM também está deprimido em múltiplos distúrbios congênitos, como diskinesia ciliar primária, fibrose cística, bem como distúrbios adquiridos como doença pulmonar obstrutiva crônica. Todos esses distúrbios estabeleceram, em alguns casos, múltiplos modelos de mouse. Nesta publicação, detalhamos um método utilizando uma pequena quantidade de radioatividade e imagem SPECT/CT de dupla modalidade para medir com precisão e reprodutivelmente o MCC em camundongos in vivo. O método permite a recuperação de camundongos após a imagem, tornando as medições seriais possíveis e testando potenciais terapêuticas longitudinalmente ao longo do tempo. Os dados em camundongos do tipo selvagem demonstram a reprodutibilidade da medição do MCC, desde que a atenção adequada aos detalhes seja dada, e o protocolo estritamente respeitado.

Usando este protocolo, anestesiamos camundongos em uma câmara isoflurane(Figura 1A). Após atingir um nível adequado de anestesia, os ratos foram colocados em suportes verticais(Figura 1B) e as cordas vocais foram visualizadas utilizando um fio-guia iluminado(Figura 1C-1D). Os camundongos foram entubados e incutidos com 0,2 mCi 99mTc-Sc em volumes de 10 μL através de uma cânula e camundongos permitidos para inalar espontaneamente nos pulmões (Figura 1E-1F). Após a aquisição e processamento da imagem, as imagens CT e SPECT foram colocalizadas(Figura 2A)utilizando o tubo fantasma como um marco(Figura 2B). Máscaras dos pulmões foram geradas a partir da imagem ct (Figura 2C) e utilizadas para desenhar ROIs ao redor do pulmão direito para análise em 0 (Figura 2D) e 6 horas(Figura 2E-2F). Para testar a reprodutibilidade do protocolo, um total de 8 camundongos foram escaneados duas vezes em dias diferentes com condições experimentais idênticas, com análise utilizando um teste t emparelhado não mostrando diferença significativa entre as repetições (p-valor=0,9904) (Figura 3A). Outros 2 camundongos foram escaneados três vezes em dias diferentes com condições experimentais idênticas, com análises utilizando ANOVA unidirecional mostrando correspondência significativa entre as varreduras repetidas (valor p de 0,0041) (Figura 3B). Um total de 8 ratos foram escaneados e duas imagens representativas foram exibidas(Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig01.jpg"> Figura 1: Intubação do rato e instilação de isótopos. Imagens dos degraus necessários para entubar e incutir isótopo nas vias aéreas. A) O rato é anestesiado em uma câmara. B) O mouse anestesiado é colocado em um suporte vertical, suspenso pelos incisivos frontais. C) Um fio de fibra óptica iluminado de 0,5 mm que serve como fio guia é preparado através de uma cânula de 20 G. D) A boca do mouse é aberta usando fórceps e iluminada usando o fio-guia iluminado para visualizar as cordas vocais. E) A cânula é empurrada através das cordas vocais e o fio-guia é removido. F) Isótopo solúvel é instilado na cânula usando uma pipeta e o rato permite inalar espontaneamente o isótopo nos pulmões. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig02v2.jpg"> Figura 2: Imagens SPECT/CT de uma varredura MCC. A) Uma imagem SPECT que foi co-localizada com uma imagem ct. B) Uma imagem ct com um tubo fantasma visível que foi usado para co-localização. C) Uma máscara das vias aéreas derivada pela binarização da imagem ct e a realização de uma projeção de soma de pilha de z. )A máscara ct co-localizada com a imagem SPECT. Um ROI para análise foi desenhado em torno do pulmão direito. E) Uma máscara das vias aéreas às 6 horas. F) Uma imagem de tomografia e SPECT co-localizada das vias aéreas às 6 horas com um ROI para análise. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig03.jpg"> Figura 3: Medidas de liberação dos mesmos camundongos em várias varreduras. A) Foram medidos dois despejos individuais de repetição para 8 camundongos sem alterações em condições experimentais. Um teste t emparelhado mostrou que não houve diferença significativa entre as repetições com um valor p de 0,9904. B) Foram medidas três folgas individuais de repetição para dois camundongos sem alterações em condições experimentais. A ANOVA unidirecional mostrou que houve correspondência significativa entre as repetições com um valor p de 0,0041. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig04.jpg"> Figura 4: Imagens de SPECT/CT co-localizadas das vias aéreas de 0 e 6 horas em 2 camundongos com ROIs desenhados em 0 e 6 horas delineando o pulmão direito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar 1: Um vídeo das cordas vocais iluminados por um fio de fibra óptica com o efeito da respiração visualizado. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929supfig01.jpg" target="_blank">Clique aqui para baixar este número.</a>
Arquivos Suplementares. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/Supplemental_Files.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar esses arquivos.</a>

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In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice

Nesta publicação, descrevemos protocolos para avaliação do desembaraço mucociliar das vias aéreas (MCC) em camundongos in vivo utilizando imagens de radionuclídeos de dupla modalidade. Este protocolo é projetado para uma tomografia computadorizada de emissão de fótons (SPECT) e um protocolo de aquisição de tomografia computadorizada (CT) usando collimadores de corpo inteiro de rato (MWB) em um sistema SPECT/CT duplo.

Avaliação in vivo de liberação mucociliaria em camundongos

Respiratory motile cilia, specialized organelles of the cell, line the apical surface of epithelial cells lining the respiratory tract. By beating in a ...

in-vivo-evaluation-of-mucociliary-clearance-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

4.3K visualizações.  University of Pittsburgh School of Medicine. Nesta publicação, descrevemos protocolos para avaliação do desembaraço mucociliar das vias aéreas (MCC) em camundongos in vivo utilizando imagens de radionuclídeos de dupla modalidade. Este protocolo é projetado para uma tomografia computadorizada de emissão de fótons (SPECT) e um protocolo de aquisição de tomografia computadorizada (CT) usando collimadores de corpo inteiro de rato (MWB) em um sistema SPECT/CT duplo.

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Murine Model of Allergen Induced Asthma

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, with the prevalence increasing.2 As with other diseases, animal models of allergic airway disease greatly facilitate understanding of the underlying pathophysiology, help identify potential therapeutic targets, and allow preclinical testing of possible new therapies. Models of allergic airway disease have been developed in several animal species, but murine models are particularly attractive due to the low cost, ready availability, and well-characterized immune systems of these animals.3 Availability of a variety of transgenic strains further increases the attractiveness of these models.4 Here we describe two murine models of allergic airway disease, both employing ovalbumin as the antigen. Following initial sensitization by intraperitoneal injection, one model delivers the antigen challenge by nebulization, the other by intratracheal delivery. These two models offer complementary advantages, with each mimicking the major features of human asthma.5
The major features of acute asthma include an exaggerated airway response to stimuli such as methacholine (airway hyperresponsiveness; AHR) and eosinophil-rich airway inflammation. These are also prominent effects of allergen challenge in our murine models,5,6 and we describe techniques for measuring them and thus evaluating the effects of experimental manipulation. Specifically, we describe both invasive7 and non-invasive8 techniques for measuring airway hyperresponsiveness as well as methods for assessing infiltration of inflammatory cells into the airways and the lung. Airway inflammatory cells are collected by bronchoalveolar lavage while lung histopathology is used to assess markers of inflammation throughout the organ. These techniques provide powerful tools for studying asthma in ways that would not be possible in humans.

Experimental mouse models of allergic asthma offer new possibilities for studying disease pathogenesis and developing new therapeutics. These models are well suited to measuring factors governing the allergic immune response, airway inflammation, and pulmonary pathophysiology.

Modelo murino de asma induzida alergénio

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

Imunologia e Infecção

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly hydrated, forming a substantial endothelial surface layer (ESL) that contributes to the maintenance of endothelial function. As the endothelial glycocalyx is often aberrant in vitro and is lost during standard tissue fixation techniques, study of the ESL requires use of intravital microscopy. To best approximate the complex physiology of the alveolar microvasculature, pulmonary intravital imaging is ideally performed on a freely-moving lung. These preparations, however, typically suffer from extensive motion artifact. We demonstrate how closed-chest intravital microscopy of a freely-moving mouse lung can be used to measure glycocalyx integrity via ESL exclusion of fluorescently-labeled high molecular weight dextrans from the endothelial surface. This non-recovery surgical technique, which requires simultaneous brightfield and fluorescent imaging of the mouse lung, allows for longitudinal observation of the subpleural microvasculature without evidence of inducing confounding lung injury.

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx/endothelial surface layer is ideally studied using intravital microscopy. Intravital microscopy is technically challenging in a moving organ such as the lung. We demonstrate how simultaneous brightfield and fluorescent microscopy may be used to estimate endothelial surface layer thickness in a freely-moving in vivo mouse lung.

Na medição in vivo da camada superficial do rato pulmonar endotelial

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

Medicina

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen interactions take advantage of intraperitoneal injections of select bacteria or pathogen associated molecular patterns (PAMPs) in mice. While these techniques have yielded tremendous data associated with infectious disease pathobiology, intraperitoneal injection models are not always appropriate for host-pathogen interaction studies in the lung. Utilizing an acute lung inflammation model in mice, it is possible to conduct a high resolution analysis of the host innate immune response utilizing lipopolysaccharide (LPS). Here, we describe the methods to administer LPS using nonsurgical oropharyngeal intratracheal administration, monitor clinical parameters associated with disease pathogenesis, and utilize bronchoalveolar lavage fluid to evaluate the host immune response. The techniques that are described are widely applicable for studying the host innate immune response to a diverse range of PAMPs and pathogens. Likewise, with minor modifications, these techniques can also be applied in studies evaluating allergic airway inflammation and in pharmacological applications.

The host immune response to pathogen infection is a tightly regulated process. Utilizing a lipopolysaccharide lung exposure model in mice, it is possible to conduct high resolution evaluations of the complex mechanisms associated with disease pathogenesis.

A utilização de orofaringe Intratraqueal Administração PAMP e Lavagem Broncoalveolar para avaliar a resposta imune do hospedeiro em camundongos

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

A Reversible, Non-invasive Method for Airway Resistance Measurements and Bronchoalveolar Lavage Fluid Sampling in Mice

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated procedures to obtain such measurements in the same animal are generally not feasible.  Here, we demonstrate protocols for obtaining from mice repeated measurements of AHR and bronchoalveolar lavage fluid samples.  Mice were challenged intranasally seven times over 14 days with a potent allergen or sham treated.  Prior to the initial challenge, and within 24 hours following each intranasal challenge, the same animals were anesthetized, orally intubated and mechanically ventilated.  AHR, assessed by comparing dose response curves of respiratory system resistance (RRS) induced by increasing intravenous doses of acetylcholine (Ach) chloride between sham and allergen-challenged animals, were determined.  Afterwards, and via the same intubation, the left lung was lavaged so that differential enumeration of airway cells could be performed.  These studies reveal that repeated measurements of AHR and BAL fluid collection are possible from the same animals and that maximal airway hyperresponsiveness and airway eosinophilia are achieved within 7-10 days of initiating allergen challenge.  This novel technique significantly reduces the number of mice required for longitudinal experimentation and is applicable to diverse rodent species, disease models and airway physiology instruments.  

Repeated measurements of rodent respiratory physiology and sampling of airway inflammatory cells are desirable, but generally not feasible. Here we describe a repeatable method for orally intubating mice that permits repeated measurements of airway hyperreactivity and sampling of airway inflammatory cells.

A reversível, método não-invasivo para medições de Resistência das Vias Aéreas e Amostragem Líquido da Lavagem Broncoalveolar em Ratos

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated ...

Biologia

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Estudar comunidades microbianas<em&gt; In Vivo</em&gt;: Um modelo de interação mediada por anfitrião entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; E<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Nas Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

The forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational tool permitting the experimental assessment of lung function in mice in a comprehensive, detailed, precise and reproducible manner. It provides measurements of respiratory system mechanics through the analysis of pressure and volume signals acquired in reaction to predefined, small amplitude, oscillatory airflow waveforms, which are typically applied at the subject's airway opening. The present protocol details the steps required to adequately execute forced oscillation measurements in mice using a computer-controlled piston ventilator (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada). The description is divided into four parts: preparatory steps, mechanical ventilation, lung function measurements, and data analysis. It also includes details of how to assess airway responsiveness to inhaled methacholine in anesthetized mice, a common application of this technique which also extends to other outcomes and various lung pathologies. Measurements obtained in na&iuml;ve mice as well as from an oxidative-stress driven model of airway damage are presented to illustrate how this tool can contribute to a better characterization and understanding of studied physiological changes or disease models as well as to applications in new research areas.

The present protocol provides a detailed step-by-step description of the procedures required to execute measurements of respiratory system mechanics as well as the assessment of airway responsiveness to inhaled methacholine in mice using the forced oscillation technique (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada).

Avaliação da mecânica respiratória em ratos usando a técnica de oscilações forçadas

The  forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational  tool permitting the experimental assessment of lung function in mice ...

Assessment of Respiratory Function in Conscious Mice by Double-chamber Plethysmography

Air volume changes created by a conscious subject breathing spontaneously within a body box are at the basis of plethysmography, a technique used to non-invasively assess some features of the respiratory function in humans as well as in laboratory animals. The present article focuses on the application of the double-chamber plethysmography (DCP) in small animals. It provides background information on the methodology as well as a detailed step-by-step procedure to successfully assess respiratory function in conscious, spontaneously breathing animals in a non-invasive manner. The DCP can be used to monitor the respiratory function of multiple animals in parallel, as well as to identify changes induced by aerosolized substances over a chosen time period and in a repeated manner. Experiments on control and allergic mice are used herein to demonstrate the utility of the technique, explain the associated outcome parameters, as well as to discuss the related advantages and shortcomings. Overall, the DCP provides valid and theoretically sound readouts that can be trusted to evaluate the respiratory function of conscious small animals both at baseline and after challenges with aerosolized substances.

The objective of the present article is to provide a detailed description of the recommended procedures to evaluate respiratory function in conscious mice by double-chamber plethysmography.

Avaliação da função respiratória em ratos conscientes por pletismografia dobro-câmara

Air volume changes created by a conscious subject breathing spontaneously within a body box are at the basis of plethysmography, a technique used to ...

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary clearance function has been established. Freshly harvested mouse trachea is cut longitudinally through the trachealis muscle and mounted in a shallow walled chamber on a glass-bottomed dish. The trachea sample is positioned along its long axis to take advantage of the trachealis muscle to curl longitudinally. This allows imaging of ciliary motion in the profile view along the entire tracheal length. Videos at 200 frames/sec are obtained using differential interference contrast microscopy and a high speed digital camera to allow quantitative analysis of cilia beat frequency and ciliary waveform. With the addition of fluorescent beads during imaging, cilia generated fluid flow also can be determined. The protocol time spans approximately 30 min, with 5 min for chamber preparation, 5-10 min for sample mounting, and 10-15 min for videomicroscopy.

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An easy and reliable technique for visualizing and quantifying airway cilia motility and cilia generated flow using mouse trachea is described. This technique can be modified to determine how a wide range of factors influence cilia motility, including pharmacological agents, genetic factors, environmental exposures, and/or mechanical factors such as mucus load.

O método ex vivo para High Resolution Imaging de Motilidade Cilia em Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful in cases of attenuated, oligo- or mono-symptomatic forms of CF usually diagnosed later in life, and of CF-related disorders such as congenital bilateral absence of vas deferens, idiopathic chronic pancreatitis, allergic bronchopulmonary aspergillosis, and bronchiectasis. In both clinical and preclinical settings, the test has been used as a biomarker to quantify responses to targeted therapeutic strategies for CF. Adapting the test to a mouse is challenging and can entail an associated mortality. This paper describes the adequate depth of anesthesia required to maintain a nasal catheter in situ for continuous perfusion. It lists measures to avoid broncho-aspiration of solutions perfused in the nose. It also describes the animal care at the end of the test, including administration of a combination of antidotes of the anesthetic drugs, leading to rapidly reversing the anesthesia with full recovery of the animals. Representative data obtained from a CF and a wild-type mouse show that the test discriminates between CF and non-CF. Altogether, the protocol described here allows reliable measurements of the functional status of trans-epithelial chloride and sodium transporters in spontaneously breathing mice, as well as multiple tests in the same animal while reducing test-related mortality.

Here, we present a protocol to measure nasal potential difference in mice. The test quantifies the function of transmembrane ion transporters such as the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and the epithelial sodium channel. It is valuable to evaluate the efficacy of novel therapies for cystic fibrosis.

Diferença de potencial nasal para quantificar o transporte do íon Trans-epitelial em ratos

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Pletismografia não invasiva de corpo inteiro em tempo real para sensibilidade à tosse em camundongos

Methods for Detecting Cough and Airway Inflammation in Mice

Chronic cough, which lasts for more than 8 weeks, is one of the most common complaints requiring medical attention, and patients suffer from a huge socioeconomic burden and a marked decrement in quality of life. Animal models can mimic the complex pathophysiology of the cough and are important tools for cough research. The detection of cough sensitivity and airway inflammation is of great significance for studying the complex pathological mechanism of cough. This article describes the measurement of cough using a noninvasive and real-time whole-body plethysmography (WBP) system and the normative procedures for harvesting tissue samples (including blood, lung, spleen, and trachea) of mice. It introduces some methods to assess airway inflammation, including pathological changes in hematoxylin and eosin (HE)-stained lung and trachea sections, the total protein concentration, the uric acid concentration, and the lactate dehydrogenase (LDH) activity in the supernatant of bronchoalveolar lavage fluid (BALF), and the leukocytes and differential cell counts of BALF. These methods are reproducible and serve as valuable tools to study the complex pathophysiology of cough.

Autor em destaque: Investigando a fisiopatologia da tosse crônica

Here, we describe the measurement of cough using a noninvasive and real-time whole-body plethysmography (WBP) system and the normative procedures for harvesting tissue samples of mice and introduce some methods to assess airway inflammation.

Métodos para detectar tosse e inflamação das vias aéreas em camundongos

Chronic cough, which lasts for more than 8 weeks, is one of the most common complaints requiring medical attention, and patients suffer from a huge ...