M.Z.とK.S.F.とこの研究は、ピットイノベーションチャレンジ(PInCh)の下で授与された助成金、ピッツバーグ大学臨床およびトランスレーショナルサイエンス研究所、およびNHLBI R01助成金HL153407によって支えられ、M.Zに授与されました。

ピッツバーグ大学の制度的動物管理および使用委員会は、これらの動物実験のいずれかを行う前に、この出版物に指定されたすべての動物プロトコルを承認しました。
注:このプロトコルは、デュアルモダリティSPECT / CTスキャナを用いた放射性核種イメージングを利用した生体内粘液構造クリアランス研究の実施方法を詳述しています。実証された技術は、システム較正の実行、マウスの麻酔、マウスの気管挿管、肺への同位体の植え付け、デュアルモダリティイメージング、これらの画像の共同登録、および分析です。
1. SPECT/CT システムのセットアップ
<ol><li>生きている動物を使って実験を行う前に、適切なワークフローを設計し、設定します。<ol>
<li>回転半径 40 cm の投影間のステップ サイズが 6o の 60 の投影から成る SPECT の取得を使用します。CTの獲得は、投影間の1.6oの 角度を持つ220の投影から成ります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>システムにマウス用の正しい MWB コリメーターと SPECT イメージングが適切であることを確認します。不適切なコリメータがインストールされている場合は、コリメーターウィザードを使用して正しいコリメータをインストールします。</li>
	<li>必要なシステムキャリブレーションを実行して、システムを使用できるように準備します。 メモ: スキャナーの SPECT および CT コンポーネントには、キャリブレーションが必要です。ソースコンディショニングとダーク/ライト(D/L)キャリブレーションを使用してCTコンポーネントを1日1回、センターオフセット(COS)キャリブレーションを2週間ごとに調整し、毎月X線ハードウェアを評価します。SPECTコンポーネントは、年に一度キャリブレーションする必要があります。<ol>
<li>X線ハードウェアを評価するには、CTキャリブレーション中に X線ハードウェアを評価 するチェックボックス(補足的なCTキャリブレーションメニュー)をチェックします。</li>
		<li>ソースコンディショニングを実行するには、CTキャリブレーション中に ソースコンディショニングを実行 チェックボックスをオンにします(補足CTキャリブレーションメニュー)。</li>
		<li>D/Lキャリブレーションを実行するには、CTキャリブレーション中の実験で使用したCT取得プロトコルの横にある D/L ボックスをチェックします。他のすべてのプロトコルのチェックを外します (補足的な CT キャリブレーション メニュー)。</li>
		<li>COSキャリブレーションを実行するには、ベッドをキャリブレーションリングツールに置き換え、モーションコントロール設定で一致するようにベッドタイプの設定を調整し、CTキャリブレーション中の実験中に使用したCT取得プロトコルの横にある COS ボックスをチェックします。他のすべてのプロトコル(補足CTキャリブレーションメニュー、補足キャリブレーションリング)のチェックを外します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. マウス挿管とインスティレーション
<ol><li>スキャンするマウスの重さを量る。複数のマウスをスキャンする場合は、耳のパンチや尾のマーキングなどの方法を使用して、マウスを識別するために注意してください。</li>
	<li>1.5%のイソフルランを使用して、ガス室に2 L/min O2のガスフローを用いて、十分な深さの麻酔を生成するために、呼吸が16分あたり〜55〜65呼吸まで遅くなるまで、マウスを麻酔する(図1A)。</li>
	<li>チャンバーからマウスを取り出し、45o傾斜の挿管スタンドのフロント切歯で吊り下げます。挿管スタンドにノーズコーンを装備して、挿管中にマウスが麻酔を受けることを確認します(図1B)。</li>
	<li>50 μm の光ファイバーワイヤの一端を光源に接続し、ワイヤーを使用して 20 ゲージのカニューレを通してガイドとして機能します (図 1C)。</li>
	<li>マウスの口を開き、鈍い鉗子を使用して舌を前方に引っ張ります。ガイドワイヤーを照らし、それを使って声帯を可視化します(図1D)。</li>
	<li>ワイヤーが声帯を越えて上気管で休むように、声帯を通してガイドワイヤーを渡します。1インチのカニューレをワイヤーに沿って前方にスライドさせてマウスを挿管し、カニューレを十分に深く通過させ、そのハブが動物の切り傷に対して行われます(図1E)。カニューレを所定の位置に残してワイヤーを取り外します。</li>
	<li>指でカニューレを短時間差し込み、呼吸の変化を確認して挿管をテストします。放出時に呼吸を止め、呼吸を加速させながら呼吸を止めたり、呼吸を緊張させたりすると、適切な気管挿管の徴候である。カニューレを差し込む際に呼吸パターンに変化がない場合、後者は食道にある可能性が高い。</li>
	<li>99mテクネチウム-硫黄コロイド(99mTc-Sc)の0.2 mCiを10μLの体積で準備し、ピペットをカニューレに入れ。マウスが1-2分以上の肺に自発的に吸い込むことを許可する(図1F)。マウスをスキャナーのパレットに移す前にカニューレを取り外します。 注:放射性核種はカーディナルヘルスによって準備され、フィルタリングされました。</li>
</ol>3. スペクター/CTイメージング
<ol><li>マウスをノーズコーンで25mmパレットに移し、テープで固定し、胸と腹部をしっかりとテープで貼り付けすぎないように注意して呼吸を損なわないようにします。マウスに取り付けられた金属の耳のタグを取り除くように注意してください。</li>
	<li>200 μL で 0.05 mCi からなる放射性ファントムを準備し、0.2 mL PCR チューブに入れます。マウスの下腹部の下のパレットにテーピングしてチューブを置き、肺との重なりを避けます。 注: ファントムは、CT 画像と SPECT 画像を共に登録する目的で使用され、またクリアランスのための負のコントロールにも使用されます。</li>
	<li>SPECT/CT システムにマウスを挿入し、イメージング ワークフローを選択して 、セットアップを実行します。</li>
	<li>マウス上の検出器の位置を設定し、イメージングワークフローを実行します。</li>
	<li>放射能後の手順を受けたマウス用のケージを準備し、食物や水への無制限のアクセス、放射線安全ステッカーを使用した明確なラベリングを行います。</li>
	<li>ワークフローが完了したら、マウスをイメージングパレットから取り出し、調理されたケージ内で、スキャンの間(スキャンの終わり1からスキャン2の開始まで)の間に6時間の間、調理されたケージ内で、食品および水へのアドリビタムアクセスで回復させます。6時間は、小胞のクリアランスが非常に少ない繊毛機能に応じて線形クリアランスが行われている期間に対応するように選択した。</li>
	<li>6時間後、マウスを再麻酔し、同じワークフローを使用して、同じワークフローを使用して、気道からクリアされた同位体の量を測定して、ファントムと一緒にスキャンします。 注:イソフルランを伴う無断麻酔として6時間回復させ、粘液性クリアランスがほぼゼロになるため、マウスが有意な繊毛抑制効果を引き起こします。</li>
</ol>4. 分析
<ol><li>イメージングの後、後処理を実行して完全な3Dスタック画像を再構築します。<ol>
<li>99mTcの工場標準設定を使用してSPECT画像をヒストグラムし、MAP3Dアルゴリズムとポイントスプレッド関数(PSF)再構築を使用して再構築します。 注: 再構築は、8 回の反復と 6 つのサブセットを使用して実行されました。効果的な再構築には、1:10での投影に対するサブセットの比率または予測数に均等に分割する必要があるため、60の予測を使用して取得したために6つのサブセットが使用されました。</li>
		<li>フェルドカンプ アルゴリズムとシェップ ローガン フィルターを使用して CT 画像を再構築します。 注: 再構築は 4 回の反復を使用して実行されました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>再スライスツールを使用して、デフォルトの軸イメージからコロナビュー画像を生成するために、フィジー ImageJ21 で CT 画像と SPECT イメージを処理します。次に、SPECT イメージに z スタック合計投影を実行して、各スライスのカウント データを追加し、分析を容易にするために 1 つの画像を生成します。</li>
	<li>ファントム・エペンドルフ・チューブを参照として、CT画像とSPECT画像のサイズ変更と登録を行います(図2A,B)。すべてのサンプルで一貫したサイズ変更の測定値を追跡し、使用します。</li>
	<li>自動閾値を使用してCT画像を二元化し、続いてスタックを反転し、Zスタック合計投影を実行して分析用の肺の輪郭を生成する(図2C)。</li>
	<li>CT 画像と SPECT イメージを回転させ、チャンネル ツールを使用して画像をマージします。右肺の周囲にROIを描画し、測定することによってMCCを計算します(図2D)。 注: この測定は、0 時間および 6 時間のタイム ポイントの右肺の合計カウントで、6 時間の画像は、式N(t) = N0e-t.99mTc-Sc は、約 6 時間の半減期で、1 秒あたり 3.21e-5の減衰定数を持っています。これらの値を使用して、パーセントクリアランスを計算できます。 注:右肺は、粘液性クリアランスが肺から咽頭から肺に放射性同位体を輸送し、胃の中で終わるので、ROIの描画と測定カウントのために選択されます。非常に頻繁に、カウントは左肺と重なり、したがって誤ったカウントを生成する可能性のある胃の中で見ることができます。この交和は、右肺のカウントのみを測定することによって回避することができます。</li>
</ol>

<ol>
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病気と発達の両方における運動性呼吸繊毛の役割は進化し続け、より良く評価される。気管気管支樹を裏打つ細胞の有頂端表面上の複数のモチル繊毛の同期的なメタクロナル拍動は、粘膜クリアランスまたはMCCを産生するセファラッド流を生成する。MCCは、PCD22のようなシリオパシーで危険にさらされ、COPD18のような病気を獲得し、その重要性は伝統的に繊毛症であるとは考えられてはいえないCHDで認識されている。最近のデータは、ヘテロタキシー23 とヘテロタキシー7のない両方のCHDで呼吸毛様機能不全を示している。このようなモチル繊毛機能不全は、より大きな呼吸症状9 ならびにより大きな術後罹患率8に変換することが示された。これらの疾患のほとんどは、すべてではないにしても、利用可能なマウスモデルを持っており、マウスのMCCを測定するためのプロトコルは、潜在的な治療法をテストするために利用できる貴重なツールです。
動物モデルは、病気を理解し、治療法の開発のための有用性を提供します。In vivo動物イメージングは、動物を犠牲にすることなく、同じ動物から複数のデータポイントを取得する機能を提供し、研究者が治療効果の研究と同様に病気の縦方向の経過をたどることを可能にする。MCCのマウスモデルは、複数の研究者によって数十年にわたって開発され、当初は平面シンチグラフィーを用いてビーグル犬に対して行われている、2次元核画像化技術24である。この技術は10年後にマウスでの使用に適応され、その後25,26の10年後にSPECTイメージングに適応した。マウスモデルにおけるこの技術の開発は、毛様体機能が大幅に変化するPCDのようなヒト疾患の複数のマウスモデルの入手可能性のために、この技術の関連性における大きな発展であった。MCCは、肺脱用および免疫抑制のマウスモデルにおいて評価されており、他のモデル19,26と組み合わせて使用される可能性を有する。CF、喘息、PCD、およびCHDに関連する繊毛症などの気道疾患を有するヒト患者におけるMCC測定試験が行われ、この技術が肺生理学および治療効果13の両方の研究を助けることができるという結果を生み出した。
このプロトコルの重要な部分は、正確な画像を定量化するために正しいイメージングパラメータを使用して取得を設定することです。SPECT取得設定を設計する際には、使用するコリメータ、回転あたりの射影数、回転ステップサイズなど、多くの要因が重要です。コリメータ選択は、取得の感度と分解能の主要な要因であり、そして取得設定は、使用されているコリメータ27に合わせて調整する必要がある場合があります。あるいは、ラットのような大きな動物を使用する場合、コリメーターを調整する必要があります。例えば複数のピンホールコリメータは、より敏感であるが、重なり合う突起を避けるためにステップサイズを選択する際には注意が必要であり、これは再構成アーティファクト25を引き起こす可能性のある画像のあいまいさを犠牲にして取得の感度をさらに高めることができる。再構成セットアップは、定量化可能な画像を生成する上でも重要です。MAP3Dは一般的に使用される反復再構成アルゴリズムであり、PSFは一般的な再構成モデルである。どちらもイメージの再構築に対して信頼性がありますが、反復回数とサブセット数を設定する際には注意が必要です。反復回数が多いほど、再構築に必要な計算時間が増加し、さらに増加するとリターンが減少して再構築の質が向上します。
ImageJ で画像を定量化するために使用する理想的な測定ツールは、選択範囲内のピクセルの合計値を出力する RawIntDen です。異なるサイズの肺ROI間でSPECTデータを定量化する場合、RawIntDenを使用すると、カウントの絶対的な尺度を提供し、平均測定が21と同様にROIの面積に対する測定の調整を回避します。
この手法には、この手法を適用する際に調査員が認識する必要がある、関連する多数のエラーの原因があります。注目すべきコンファウンダーは、麻酔薬の使用です。イオブルランは、マウスが取得完了後に急速に回復する速い作用、吸入麻酔薬です。しかし、マウスにケージ内で回復するのに十分な時間を与え、必要以上に麻酔を受けないように注意する必要があります。私たちの個人的な経験(未発表のデータ)では、0時間から6時間の間に吸入イオブルランを使用して麻酔を連続的に維持されたマウスは、無視できるクリアランスを示した。同様に、迅速な回復を確実にするためには、麻酔薬の制御用量も必要です。画像処理のために動物をパレットに固定する場合、人工物が肺と重ならないように、共同登録に使用される幻の管を胃の上に低く保つ必要があります。同様に、CT 画像の品質を確保するために、マウスから金属タグを取り除き、X線散乱からアーチファクトを避けるように注意してください。
現在のMCCプロトコルは無数の動物モデルに適用することができる。この技術は、スキャンされた動物の健康にごくわずかな影響を及ぼし、マウスによって十分に許容され、このため既に繊細なマウスの健康を危険にさらすことなく疾患モデルで使用することができる。この方法論の強さは、ビデオ顕微鏡のために気管を切除するために動物を犠牲にすることなく気道機能の一貫した反復可能な測定値を取得することを可能にするin vivo技術であることから来る、ex vivoモデルは26を必要とする。同じ動物の複数のスキャンで反復可能な測定を生成するこの技術の一貫性は、同じ動物が異なる薬剤または潜在的な治療で治療されることを可能にし、そして任意の動物モデルに内在する生物学的変動性を減少させるために同じ動物間で行われた統計的比較を可能にし、それによって統計的に有意な差を示すために必要なサンプルサイズを減少させる。
MCC技術を用いた気道機能の評価は、さまざまな動物モデルに調整し、気道の健康の多くの異なるモデルに適用するだけでなく、新しい治療法をテストすることができます。PCDのマウスモデルの気道は、この技術だけでなく、COPDのモデルを使用して評価することができます。また、一般的な臨床使用のMCCに対する様々な麻酔薬の差動効果を研究するためにも利用できます。最後に、このモデルを用いて、気道に対する治療剤の効果を評価することもできる。先に述べたように、繰り返しクマ, それはインビボ測定であるため、それは病気の過程で繰り返しMCC評価を可能にします, だけでなく、時間の経過と共に治療介入のテストの利点.さらに、マウスはヒト疾患を模倣/研究するために使用される最も一般的な実験動物であり、場合によっては、ヒト疾患の複数のトランスジェニックマウスモデルから選択できる。

繊毛は、藻類からヒトまでの進化史を通じて保存された微小管ベースの細胞小器官である。それらは細胞表面から発せられると多くの機能を有する1、局所的な環境感覚信号の認識から運動性、ヒトから初期の単細胞真核生物にまでさかのぼることができる機能2、3に至るまで。Ciliaは非運動性であり、環境信号を処理するセルの特殊なアンテナとして単一の役割を果たすことができます。またはモチルと倍数、同期して叩く、転移波は、卵管の内層や上下気道など流体の流れを発生させる、1、2に至る末端気管支を除く。
気道の広範な上皮表面は、潜在的に危険な汚染物質および病原体の形で汚染の絶え間ない集中砲火にさらされ、防御を必要とする。1つの重要な防御機構は気管気管支柱の粘液性装置であり、気管気管支上皮細胞の有端な表面を裏打ちする複数のモチル繊毛の叩きによって、分泌された粘液の連続的な流れが気道から機械的に運び出される。吸入された汚染物質を捕捉するこれらの機能、およびそれらの連続的な、同期の鼓動を通して、それらをセファルド4、5を輸送する。
繊毛は、胚発生における左右のパターン形成の発達などにおいて重要な役割を果たしていることが実証されており、胚節のモチル繊毛は対称性を破る6。繊毛関連遺伝子の変異は、心臓の非対称構造による先天性心疾患(CHD)などの疾患に関連している。最近の研究では、CHD患者の気道における毛様機能不全の発生率が高く、また、上気道および下部気道7、8、9、10における術後呼吸器合併症および慢性気道症状の有病率の増加が報告されている。CHDおよび毛様機能不全を有する患者は、ヘテロタキシーの有無にかかわらず、術後の呼吸合併症および陰性呼吸転帰のリスクが5、8、10に増加することが実証されている。シグナリングと発達における彼らの役割を超えて、気道繊毛の重要性は、主要な毛様体異形成(PCD)である毛様症によって実証されている。PCDは、運動性呼吸器繊毛に影響を及ぼす多数の突然変異に起因する先天性障害であり、再発性肺感染症、気管支拡張症、および肺移植の必要性を引き起こす可能性がある11。さらに、嚢胞性線維症(CF)において繊毛が正常であるにもかかわらず、白人集団において最も一般的な先天性障害は、CFTR遺伝子12の突然変異に起因する厚い粘膜粘液が厚いために障害される。PCDとCFの複数のマウスモデルと、CHDのモデルが増え続けています。最終的に繊毛は多くの重要な役割を持つ多目的な構造であり、生体内の運動性呼吸繊毛の機能を評価する方法は、前臨床研究に有用であり、突然変異および粘膜クリアランス(MCC)13に対する薬物の影響を評価する方法である。この方法は、これらのマウスモデルにおけるMCCに対する新規薬物、遺伝子治療または介入の影響を評価する上でも価値がある。
MCC の評価に使用されているさまざまなモデルがあります。1つの注目すべき方法は、気管支に植え付けられたメチレンブルー染料を使用することを含み、色素運動14の光ファイバー測定によって測定されたクリアランスを有する。この方法は、前臨床マウスモデルよりもヒトでより日常的である色素の動きを観察する能力によって制限される。もう一つの注目すべき方法は、放射光相対位X線イメージング(PCXI)であり、気道内の個々の粒子を追跡するために使用することができます。この方法は比較的新しく、広くアクセスできない15です。ビデオ顕微鏡用気管を切除することによって気道を評価する数多くのex vivo方法がありますが、これらのモデルはヒト患者16にはほとんど有用性を提供しません。光コヘレンス断層撮影などの繊毛イメージングの高解像度技術は、同じように17に制限されている。
本稿では、無数の動物モデルにおける肺クリアランスの測定に用いられてきたMCC in vivoを測定する再現性のある方法を提示するとともに、慢性閉塞性肺疾患におけるMCCの研究と免疫抑制薬18,19の効果を評価する。この方法は、肺への注入後に、不溶性微粒子放射性トレーサーである放射性医薬品99mテクネチウム硫黄コロイド(99mTc-Sc)のクリアランスを追跡する。放射性核種は、単一光子放出コンピュータ断層撮影(SPECT)18,20を使用して追跡することができる。我々は、肺への放射性同位元素数の共局在化とデュアルモダリティSPECTとコンピュータ断層撮影(CT)イメージングを使用して、6時間にわたってこれらのカウントの減少を測定することにより、MCCを測定するためのこの技術をさらに洗練しました。二重モダリティイメージングは、CT画像とSPECT画像の共登録により、対象領域である肺に対する放射線数の正確な局在化を可能にします。マウスにおけるMCC測定法については詳細に説明するが、プロトコルはラットのMCCを研究するように調整することができる。コリメーターは放射線量と同様に調整する必要があります。我々の見解では、マウスMCCスキャンは、小さな動物の大きさのために技術的に困難であるが、多くのヒト障害の確立されたマウスモデルの数が多いため、ラットよりも有用である。さらに、動物コロニーの低コストとメンテナンスコストのために、より大きなサンプルサイズはマウスでより実行可能です。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>500 &#181;m Unjacketed Fiber Optic Wire</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>02-532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99mTechnecium-Sulfur Colloid</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Vaporizer</td>
			<td>Vetland Medical</td>
			<td>A13480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durmont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>99150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65/1.52p Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Introcan Safety Catheters 20G 1inch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1534477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>118-2097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Intubation Stand</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>ETI-MSE-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siemens Inveon dual-modality SPECT/CT</td>
			<td>Siemens</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Anesthesia Stand</td>
			<td>Summit Anesthesia Solutions</td>
			<td>22860</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo evaluation of mucociliary clearance in mice

呼吸性繊毛は、細胞の専門の小器官であり、気道を裏打ちする上皮細胞の上端表面を並べる。メタクロナル、シンクロナル様式で殴打することにより、これらの複数の、運動性、アクチンベースのオルガネラは、吸入汚染物質および病原体の気道をクリアするセファラッド流体流れを生成する。環境汚染の増加に伴い、新しいウイルス病原体および新たな多剤耐性菌は、繊毛発生粘液性クリアランス(MCC)が肺の健康維持に不可欠である。MCCはまた、原発性毛様体異性症、嚢胞性線維症、ならびに慢性閉塞性肺疾患のような後天性障害のような複数の先天性疾患でうつ病である。これらすべての障害は、いくつかのケースでは、複数のマウスモデルを確立しています。本稿では、少量の放射能とデュアルモダリティSPECT/CTイメージングを用いて、生体内マウスのMCCを正確かつ再現的に測定する方法について詳述する。この方法は、イメージング後のマウスの回収を可能にし、連続測定を可能にし、時間の経過とともに長い間潜在的な治療薬をテストする。野生型マウスのデータは、細部に十分な注意が払われ、プロトコルが厳密に付着している限り、MCC測定の再現性を示す。

このプロトコルを用いて、イオブルランチャンバー内のマウスを麻酔した(図1A)。十分なレベルの麻酔を達成した後、マウスを垂直支持に置き(図1B)、発声コードを照らされたガイドワイヤーを使用して可視化した(図1C-1D)。マウスを挿管し、カニューレを介して10μLの体積で0.2 mCi 99mTc-Scを植え付け、マウスは肺に自発的に吸入することを許した(図1E-1F)。画像の取得と処理の後、CT画像とSPECT画像をランドマークとして使用して共局化した(図2A)。肺のマスクは、CT画像(図2C)から生成され、0(図2D)および6時間(図2E-2F)で分析するために右肺の周りにROIを描くために使用した。プロトコルの再現性をテストするために、同じ実験条件を持つ異なる日に合計8匹のマウスを2回スキャンし、繰り返しスキャンの間に有意な差を示さないペアのt検定を用いた分析(p値=0.9904)(図3A)。さらに2匹のマウスを同一の実験条件で異なる日に3回スキャンし、一方向ANOVAを用いた分析では、反復スキャン間の有意な一致を示す(図3B)。計8匹のマウスをスキャンし、2つの代表的な画像を表示した(図4)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig01.jpg"> 図1:マウス挿管と同位体の内挿。気道に同位体を挿管し、植え付けるために必要なステップの画像。 A) マウスはチャンバー内で麻酔を受ける。 B)麻酔マウスを垂直支持に置き、フロント切歯によって吊り下げ。 C)ガイドワイヤとして機能する光ファイバーワイヤを照射した0.5mmの光ファイバーワイヤーは、20 Gカニューレを通してそれを実行することによって準備されます。 D)マウスの口は鉗子を使って開き、照明付きガイドワイヤーを使って声帯を視覚化する。 E)カニューレは声帯を横切って押され、ガイドワイヤーは取り外される。 F)可溶性同位体はピペットを用いてカニューレに植え付け、マウスは自発的に同位体を肺に吸い込む。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig02v2.jpg"> 図 2: MCC スキャンの SPECT/CT イメージA) CT イメージと共にローカライズされた SPECT イメージ。 B)共局化に使用された可視幻のチューブを持つCT画像。 C)CT画像を二値化し、zスタックの合計投影を行うことによって導出される気道のマスク。 D)SPECT イメージと共にローカライズされた CT マスク。右肺の周囲に分析用のROIが描かれています。 E)6時間で気道のマスク。 F)分析用ROIと6時間の気道のCTおよびSPECTの共局化画像。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig03.jpg"> 図3:複数のスキャンで同じマウスのクリアランス測定。A)実験条件に変化のない8匹のマウスについて2個の反復クリアランスを測定した。ペアのt検定では、p値0.9904の繰り返しスキャンに有意な差がないことを示した。 B)実験条件に変化のない2匹のマウスについて3つの個別の反復クリアランスを測定した。一方向の分散分析は、p値0.0041の繰り返しスキャンの間に有意な一致があることを示した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig04.jpg"> 図4:右肺を概説する0時間と6時間でROIを描いた2匹のマウスにおける0時間および6時間の気道の共局化されたSPECT/CT画像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:呼吸効果を可視化した光ファイバーワイヤーで照らされた声帯の映像。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929supfig01.jpg" target="_blank">こちらをダウンロードしてください。</a>
補助ファイル。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/Supplemental_Files.zip" target="_blank">これらのファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice

本稿では、二相様式放射性核種イメージングを利用したマウスの生体内における気道粘膜クリアランス(MCC)を評価するためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、デュアルSPECT/CTシステムでマウス全身(MWB)コリメータを使用した単一光子放射コンピュータ断層撮影(SPECT)およびコンピュータ断層撮影プロトコル用に設計されています。

マウスにおける粘膜クリアランスのインビボ評価

Respiratory motile cilia, specialized organelles of the cell, line the apical surface of epithelial cells lining the respiratory tract. By beating in a ...

in-vivo-evaluation-of-mucociliary-clearance-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

4.2K ビュー.  University of Pittsburgh School of Medicine. 本稿では、二相様式放射性核種イメージングを利用したマウスの生体内における気道粘膜クリアランス(MCC)を評価するためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、デュアルSPECT/CTシステムでマウス全身(MWB)コリメータを使用した単一光子放射コンピュータ断層撮影(SPECT)およびコンピュータ断層撮影プロトコル用に設計されています。

ビデオ: In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

レイヤーin vivoでの2光子カルシウムイメージングマウスの2 / 3

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

生物学

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

電離放射線は、次のγH2AXの空間分布の評価

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

イオンチャネル研究のためのパッチクランプおよび灌流のテクニックで表さアフリカツメガエル卵母細胞

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the production of new mouse models of disease and investigations into the hormonal regulation of tissue degeneration (or regeneration) following pathological challenge. The murine reproductive (or estrous) cycle is divided into 4 stages: proestrus, estrus, metestrus, and diestrus. Defined fluctuations in circulating levels of the ovarian steroids 17-&beta;-estradiol and progesterone, the gonadotropins luteinizing and follicle stimulating hormones, and the luteotropic hormone prolactin signal transition through these reproductive stages. Changes in cell typology within the murine vaginal canal reflect these underlying endocrine events. Daily assessment of the relative ratio of nucleated epithelial cells, cornified squamous epithelial cells, and leukocytes present in vaginal smears can be used to identify murine estrous stages. The degree of invasiveness, however, employed in collecting these samples can alter reproductive status and elicit an inflammatory response that can confound cytological assessment of smears. Here, we describe a simple, non-invasive protocol that can be used to determine the stage of the estrous cycle of a female mouse without altering her reproductive cycle. We detail how to differentiate between the four stages of the estrous cycle by collection and analysis of predominant cell typology in vaginal smears and we show how these changes can be interpreted with respect to endocrine status.

Here, we describe how to identify the stage of the murine reproductive (proestrus, estrus, metestrus, or diestrus) by simple, non-invasive collection and cytological assessment of vaginal smear samples. We further describe how vaginal cytology reflects circulating hormonal levels underlying transition through the murine reproductive cycle.

膣洗浄、クリスタルバイオレット染色、およびマウス発情周期ステージング識別のための膣細胞学的評価を行う

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

アポトーシス細胞のクリアランスのイメージング中に生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

The forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational tool permitting the experimental assessment of lung function in mice in a comprehensive, detailed, precise and reproducible manner. It provides measurements of respiratory system mechanics through the analysis of pressure and volume signals acquired in reaction to predefined, small amplitude, oscillatory airflow waveforms, which are typically applied at the subject's airway opening. The present protocol details the steps required to adequately execute forced oscillation measurements in mice using a computer-controlled piston ventilator (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada). The description is divided into four parts: preparatory steps, mechanical ventilation, lung function measurements, and data analysis. It also includes details of how to assess airway responsiveness to inhaled methacholine in anesthetized mice, a common application of this technique which also extends to other outcomes and various lung pathologies. Measurements obtained in na&iuml;ve mice as well as from an oxidative-stress driven model of airway damage are presented to illustrate how this tool can contribute to a better characterization and understanding of studied physiological changes or disease models as well as to applications in new research areas.

The present protocol provides a detailed step-by-step description of the procedures required to execute measurements of respiratory system mechanics as well as the assessment of airway responsiveness to inhaled methacholine in mice using the forced oscillation technique (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada).

強制振動法を用いたマウスにおける呼吸器系の力学の評価

The  forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational  tool permitting the experimental assessment of lung function in mice ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Body movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are sheathed by intramuscular connective tissues. Each myofiber contains many myofibrils that run longitudinally along the length of the myofiber. Myofibrils are the contractile apparatus of muscle and they are composed of repeated contractile units known as sarcomeres. A sarcomere unit contains actin and myosin filaments that are spaced by the Z discs and titin protein. Mechanical function of skeletal muscle is defined by the contractile and passive properties of muscle. The contractile properties are used to characterize the amount of force generated during muscle contraction, time of force generation and time of muscle relaxation. Any factor that affects muscle contraction (such as interaction between actin and myosin filaments, homeostasis of calcium, ATP/ADP ratio, etc.) influences the contractile properties. The passive properties refer to the elastic and viscous properties (stiffness and viscosity) of the muscle in the absence of contraction. These properties are determined by the extracellular and the intracellular structural components (such as titin) and connective tissues (mainly collagen) 1-2. The contractile and passive properties are two inseparable aspects of muscle function. For example, elbow flexion is accomplished by contraction of muscles in the anterior compartment of the upper arm and passive stretch of muscles in the posterior compartment of the upper arm. To truly understand muscle function, both contractile and passive properties should be studied.
The contractile and/or passive mechanical properties of muscle are often compromised in muscle diseases. A good example is Duchenne muscular dystrophy (DMD), a severe muscle wasting disease caused by dystrophin deficiency 3. Dystrophin is a cytoskeletal protein that stabilizes the muscle cell membrane (sarcolemma) during muscle contraction 4. In the absence of dystrophin, the sarcolemma is damaged by the shearing force generated during force transmission. This membrane tearing initiates a chain reaction which leads to muscle cell death and loss of contractile machinery. As a consequence, muscle force is reduced and dead myofibers are replaced by fibrotic tissues 5. This later change increases muscle stiffness 6. Accurate measurement of these changes provides important guide to evaluate disease progression and to determine therapeutic efficacy of novel gene/cell/pharmacological interventions. Here, we present two methods to evaluate both contractile and passive mechanical properties of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and the contractile properties of the tibialis anterior (TA) muscle.

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Changes in limb muscle contractile and passive mechanical properties are important biomarkers for muscle diseases. This manuscript describes physiological assays to measure these properties in the murine extensor digitorum longus and tibialis anterior muscles.

長指伸筋の筋機能の評価<em&gt;エクスビボ</em&gt;と前脛骨筋<em&gt;その場</em&gt;マウスの

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

マウスにおける急速な非侵襲腰椎髄腔内注射を経由して生体内 siRNAトランスフェクションと脊髄における遺伝子ノックダウン

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

蛍光クリアランスアッセイを用いてゼブラフィッシュ腎臓機能の評価

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

の剛性を測定します<em&gt; ex vivoで</em原子間力顕微鏡を使用&gt;マウス大動脈

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...