M.Z.とK.S.F.とこの研究は、ピットイノベーションチャレンジ(PInCh)の下で授与された助成金、ピッツバーグ大学臨床およびトランスレーショナルサイエンス研究所、およびNHLBI R01助成金HL153407によって支えられ、M.Zに授与されました。

ピッツバーグ大学の制度的動物管理および使用委員会は、これらの動物実験のいずれかを行う前に、この出版物に指定されたすべての動物プロトコルを承認しました。
注:このプロトコルは、デュアルモダリティSPECT / CTスキャナを用いた放射性核種イメージングを利用した生体内粘液構造クリアランス研究の実施方法を詳述しています。実証された技術は、システム較正の実行、マウスの麻酔、マウスの気管挿管、肺への同位体の植え付け、デュアルモダリティイメージング、これらの画像の共同登録、および分析です。
1. SPECT/CT システムのセットアップ
<ol><li>生きている動物を使って実験を行う前に、適切なワークフローを設計し、設定します。<ol>
<li>回転半径 40 cm の投影間のステップ サイズが 6o の 60 の投影から成る SPECT の取得を使用します。CTの獲得は、投影間の1.6oの 角度を持つ220の投影から成ります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>システムにマウス用の正しい MWB コリメーターと SPECT イメージングが適切であることを確認します。不適切なコリメータがインストールされている場合は、コリメーターウィザードを使用して正しいコリメータをインストールします。</li>
	<li>必要なシステムキャリブレーションを実行して、システムを使用できるように準備します。 メモ: スキャナーの SPECT および CT コンポーネントには、キャリブレーションが必要です。ソースコンディショニングとダーク/ライト(D/L)キャリブレーションを使用してCTコンポーネントを1日1回、センターオフセット(COS)キャリブレーションを2週間ごとに調整し、毎月X線ハードウェアを評価します。SPECTコンポーネントは、年に一度キャリブレーションする必要があります。<ol>
<li>X線ハードウェアを評価するには、CTキャリブレーション中に X線ハードウェアを評価 するチェックボックス(補足的なCTキャリブレーションメニュー)をチェックします。</li>
		<li>ソースコンディショニングを実行するには、CTキャリブレーション中に ソースコンディショニングを実行 チェックボックスをオンにします(補足CTキャリブレーションメニュー)。</li>
		<li>D/Lキャリブレーションを実行するには、CTキャリブレーション中の実験で使用したCT取得プロトコルの横にある D/L ボックスをチェックします。他のすべてのプロトコルのチェックを外します (補足的な CT キャリブレーション メニュー)。</li>
		<li>COSキャリブレーションを実行するには、ベッドをキャリブレーションリングツールに置き換え、モーションコントロール設定で一致するようにベッドタイプの設定を調整し、CTキャリブレーション中の実験中に使用したCT取得プロトコルの横にある COS ボックスをチェックします。他のすべてのプロトコル(補足CTキャリブレーションメニュー、補足キャリブレーションリング)のチェックを外します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. マウス挿管とインスティレーション
<ol><li>スキャンするマウスの重さを量る。複数のマウスをスキャンする場合は、耳のパンチや尾のマーキングなどの方法を使用して、マウスを識別するために注意してください。</li>
	<li>1.5%のイソフルランを使用して、ガス室に2 L/min O2のガスフローを用いて、十分な深さの麻酔を生成するために、呼吸が16分あたり〜55〜65呼吸まで遅くなるまで、マウスを麻酔する(図1A)。</li>
	<li>チャンバーからマウスを取り出し、45o傾斜の挿管スタンドのフロント切歯で吊り下げます。挿管スタンドにノーズコーンを装備して、挿管中にマウスが麻酔を受けることを確認します(図1B)。</li>
	<li>50 μm の光ファイバーワイヤの一端を光源に接続し、ワイヤーを使用して 20 ゲージのカニューレを通してガイドとして機能します (図 1C)。</li>
	<li>マウスの口を開き、鈍い鉗子を使用して舌を前方に引っ張ります。ガイドワイヤーを照らし、それを使って声帯を可視化します(図1D)。</li>
	<li>ワイヤーが声帯を越えて上気管で休むように、声帯を通してガイドワイヤーを渡します。1インチのカニューレをワイヤーに沿って前方にスライドさせてマウスを挿管し、カニューレを十分に深く通過させ、そのハブが動物の切り傷に対して行われます(図1E)。カニューレを所定の位置に残してワイヤーを取り外します。</li>
	<li>指でカニューレを短時間差し込み、呼吸の変化を確認して挿管をテストします。放出時に呼吸を止め、呼吸を加速させながら呼吸を止めたり、呼吸を緊張させたりすると、適切な気管挿管の徴候である。カニューレを差し込む際に呼吸パターンに変化がない場合、後者は食道にある可能性が高い。</li>
	<li>99mテクネチウム-硫黄コロイド(99mTc-Sc)の0.2 mCiを10μLの体積で準備し、ピペットをカニューレに入れ。マウスが1-2分以上の肺に自発的に吸い込むことを許可する(図1F)。マウスをスキャナーのパレットに移す前にカニューレを取り外します。 注:放射性核種はカーディナルヘルスによって準備され、フィルタリングされました。</li>
</ol>3. スペクター/CTイメージング
<ol><li>マウスをノーズコーンで25mmパレットに移し、テープで固定し、胸と腹部をしっかりとテープで貼り付けすぎないように注意して呼吸を損なわないようにします。マウスに取り付けられた金属の耳のタグを取り除くように注意してください。</li>
	<li>200 μL で 0.05 mCi からなる放射性ファントムを準備し、0.2 mL PCR チューブに入れます。マウスの下腹部の下のパレットにテーピングしてチューブを置き、肺との重なりを避けます。 注: ファントムは、CT 画像と SPECT 画像を共に登録する目的で使用され、またクリアランスのための負のコントロールにも使用されます。</li>
	<li>SPECT/CT システムにマウスを挿入し、イメージング ワークフローを選択して 、セットアップを実行します。</li>
	<li>マウス上の検出器の位置を設定し、イメージングワークフローを実行します。</li>
	<li>放射能後の手順を受けたマウス用のケージを準備し、食物や水への無制限のアクセス、放射線安全ステッカーを使用した明確なラベリングを行います。</li>
	<li>ワークフローが完了したら、マウスをイメージングパレットから取り出し、調理されたケージ内で、スキャンの間(スキャンの終わり1からスキャン2の開始まで)の間に6時間の間、調理されたケージ内で、食品および水へのアドリビタムアクセスで回復させます。6時間は、小胞のクリアランスが非常に少ない繊毛機能に応じて線形クリアランスが行われている期間に対応するように選択した。</li>
	<li>6時間後、マウスを再麻酔し、同じワークフローを使用して、同じワークフローを使用して、気道からクリアされた同位体の量を測定して、ファントムと一緒にスキャンします。 注:イソフルランを伴う無断麻酔として6時間回復させ、粘液性クリアランスがほぼゼロになるため、マウスが有意な繊毛抑制効果を引き起こします。</li>
</ol>4. 分析
<ol><li>イメージングの後、後処理を実行して完全な3Dスタック画像を再構築します。<ol>
<li>99mTcの工場標準設定を使用してSPECT画像をヒストグラムし、MAP3Dアルゴリズムとポイントスプレッド関数(PSF)再構築を使用して再構築します。 注: 再構築は、8 回の反復と 6 つのサブセットを使用して実行されました。効果的な再構築には、1:10での投影に対するサブセットの比率または予測数に均等に分割する必要があるため、60の予測を使用して取得したために6つのサブセットが使用されました。</li>
		<li>フェルドカンプ アルゴリズムとシェップ ローガン フィルターを使用して CT 画像を再構築します。 注: 再構築は 4 回の反復を使用して実行されました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>再スライスツールを使用して、デフォルトの軸イメージからコロナビュー画像を生成するために、フィジー ImageJ21 で CT 画像と SPECT イメージを処理します。次に、SPECT イメージに z スタック合計投影を実行して、各スライスのカウント データを追加し、分析を容易にするために 1 つの画像を生成します。</li>
	<li>ファントム・エペンドルフ・チューブを参照として、CT画像とSPECT画像のサイズ変更と登録を行います(図2A,B)。すべてのサンプルで一貫したサイズ変更の測定値を追跡し、使用します。</li>
	<li>自動閾値を使用してCT画像を二元化し、続いてスタックを反転し、Zスタック合計投影を実行して分析用の肺の輪郭を生成する(図2C)。</li>
	<li>CT 画像と SPECT イメージを回転させ、チャンネル ツールを使用して画像をマージします。右肺の周囲にROIを描画し、測定することによってMCCを計算します(図2D)。 注: この測定は、0 時間および 6 時間のタイム ポイントの右肺の合計カウントで、6 時間の画像は、式N(t) = N0e-t.99mTc-Sc は、約 6 時間の半減期で、1 秒あたり 3.21e-5の減衰定数を持っています。これらの値を使用して、パーセントクリアランスを計算できます。 注:右肺は、粘液性クリアランスが肺から咽頭から肺に放射性同位体を輸送し、胃の中で終わるので、ROIの描画と測定カウントのために選択されます。非常に頻繁に、カウントは左肺と重なり、したがって誤ったカウントを生成する可能性のある胃の中で見ることができます。この交和は、右肺のカウントのみを測定することによって回避することができます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Afzelius, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia-related+diseases.">Cilia-related diseases.</a> Journal of Pathology. 204 (4), 470-477 (2004).</li><li>Mitchell, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+eukaryotic+cilia+and+flagella+as+motile+and+sensory+organelles.">The evolution of eukaryotic cilia and flagella as motile and sensory organelles.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 607, 130-140 (2007).</li><li>Carvalho-Santos, Z., Azimzadeh, J., Pereira-Leal, J. B., Bettencourt-Dias, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution:+Tracing+the+origins+of+centrioles,+cilia,+and+flagella.">Evolution: Tracing the origins of centrioles, cilia, and flagella.</a> Journal of Cell Biology. 194 (2), 165-175 (2011).</li><li>Randell, S. H., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=University+of+North+Carolina+Virtual+Lung,+G.+Effective+mucus+clearance+is+essential+for+respiratory+health.">University of North Carolina Virtual Lung, G. Effective mucus clearance is essential for respiratory health.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 35 (1), 20-28 (2006).</li><li>Wanner, A., Salathe, M., O'Riordan, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucociliary+clearance+in+the+airways.">Mucociliary clearance in the airways.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 154, 1868-1902 (1996).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+genetic+analysis+in+mice+unveils+central+role+for+cilia+in+congenital+heart+disease.">Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease.</a> Nature. 521 (7553), 520-524 (2015).</li><li>Zahid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+ciliary+dysfunction+and+respiratory+symptoms+in+patients+with+transposition+of+the+great+arteries.">Airway ciliary dysfunction and respiratory symptoms in patients with transposition of the great arteries.</a> PLoS One. 13 (2), 0191605 (2018).</li><li>Stewart, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+ciliary+dysfunction:+Association+with+adverse+postoperative+outcomes+in+nonheterotaxy+congenital+heart+disease+patients.">Airway ciliary dysfunction: Association with adverse postoperative outcomes in nonheterotaxy congenital heart disease patients.</a> Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (2), 755-763 (2018).</li><li>Garrod, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+ciliary+dysfunction+and+sinopulmonary+symptoms+in+patients+with+congenital+heart+disease.">Airway ciliary dysfunction and sinopulmonary symptoms in patients with congenital heart disease.</a> Annals of the American Thoracic Society. 11 (9), 1426-1432 (2014).</li><li>Harden, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+postoperative+respiratory+complications+in+heterotaxy+congenital+heart+disease+patients+with+respiratory+ciliary+dysfunction.">Increased postoperative respiratory complications in heterotaxy congenital heart disease patients with respiratory ciliary dysfunction.</a> Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 147 (4), 1291-1298 (2014).</li><li>Leigh, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+genetic+aspects+of+primary+ciliary+dyskinesia/Kartagener+syndrome.">Clinical and genetic aspects of primary ciliary dyskinesia/Kartagener syndrome.</a> Genetics in Medicine. 11 (7), 473-487 (2009).</li><li>Donaldson, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ivacaftor+on+mucociliary+clearance+and+clinical+outcomes+in+cystic+fibrosis+patients+with+G551D-CFTR.">Effect of ivacaftor on mucociliary clearance and clinical outcomes in cystic fibrosis patients with G551D-CFTR.</a> JCI Insight. 3 (24), (2018).</li><li>Donaldson, S. H., Corcoran, T. E., Laube, B. L., Bennett, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucociliary+clearance+as+an+outcome+measure+for+cystic+fibrosis+clinical+research.">Mucociliary clearance as an outcome measure for cystic fibrosis clinical research.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 4 (4), 399-405 (2007).</li><li>Ledowski, T., Hilmi, S., Paech, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchial+mucus+transport+velocity+in+patients+receiving+anaesthesia+with+propofol+and+morphine+or+propofol+and+remifentanil.">Bronchial mucus transport velocity in patients receiving anaesthesia with propofol and morphine or propofol and remifentanil.</a> Anaesthesia. 61 (8), 747-751 (2006).</li><li>Donnelley, M., Morgan, K. S., Siu, K. K., Parsons, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dry+deposition+of+pollutant+and+marker+particles+onto+live+mouse+airway+surfaces+enhances+monitoring+of+individual+particle+mucociliary+transit+behaviour.">Dry deposition of pollutant and marker particles onto live mouse airway surfaces enhances monitoring of individual particle mucociliary transit behaviour.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19, 551-558 (2012).</li><li>Christopher, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+temperature+and+anesthetic+agents+on+ciliary+function+in+murine+respiratory+epithelia.">The effects of temperature and anesthetic agents on ciliary function in murine respiratory epithelia.</a> Frontiers in Pediatrics. 2, 111 (2014).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+quantitative+study+of+airway+functional+microanatomy+using+micro-optical+coherence+tomography.">Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography.</a> PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).</li><li>Lam, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+6-mediated+selective+autophagy+regulates+COPD-associated+cilia+dysfunction.">Histone deacetylase 6-mediated selective autophagy regulates COPD-associated cilia dysfunction.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5212-5230 (2013).</li><li>Bhashyam, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pilot+study+to+examine+the+effect+of+chronic+treatment+with+immunosuppressive+drugs+on+mucociliary+clearance+in+a+vagotomized+murine+model.">A pilot study to examine the effect of chronic treatment with immunosuppressive drugs on mucociliary clearance in a vagotomized murine model.</a> PLoS One. 7 (9), 45312 (2012).</li><li>Ortiz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Mucociliary+Clearance+by+Three+Dimension+Micro-CT-SPECT+in+Guinea+Pig:+Role+of+Bitter+Taste+Agonists.">Evaluation of Mucociliary Clearance by Three Dimension Micro-CT-SPECT in Guinea Pig: Role of Bitter Taste Agonists.</a> PLoS One. 11 (10), 0164399 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Solomon, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+ciliary+phenotype+in+primary+ciliary+dyskinesia+by+micro-optical+coherence+tomography.">Assessment of ciliary phenotype in primary ciliary dyskinesia by micro-optical coherence tomography.</a> JCI Insight. 2 (5), 91702 (2017).</li><li>Nakhleh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+respiratory+ciliary+dysfunction+in+congenital+heart+disease+patients+with+heterotaxy.">High prevalence of respiratory ciliary dysfunction in congenital heart disease patients with heterotaxy.</a> Circulation. 125 (18), 2232-2242 (2012).</li><li>Whaley, S. L., Renken, S., Muggenburg, B. A., Wolff, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+for+aerosol+deposition+restricted+to+the+nose+in+beagle+dogs.">Technique for aerosol deposition restricted to the nose in beagle dogs.</a> Journal of Toxicology and Environmental Health. 23 (4), 519-525 (1988).</li><li>Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+for+the+measurement+of+mucociliary+function+in+the+mouse+by+scintigraphy.">Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy.</a> Journal of Applied Physiology. 90 (3), 1111-1117 (2001).</li><li>Bhashyam, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vagal+control+of+mucociliary+clearance+in+murine+lungs:+a+study+in+a+chronic+preparation.">Vagal control of mucociliary clearance in murine lungs: a study in a chronic preparation.</a> Autonomic Neuroscience. 154 (1-2), 74-78 (2010).</li><li>Van Audenhaege, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+SPECT+collimator+selection,+optimization,+and+fabrication+for+clinical+and+preclinical+imaging.">Review of SPECT collimator selection, optimization, and fabrication for clinical and preclinical imaging.</a> Medical Physics. 42 (8), 4796-4813 (2015).</li></ol>

この作品に関連するものはありません。

病気と発達の両方における運動性呼吸繊毛の役割は進化し続け、より良く評価される。気管気管支樹を裏打つ細胞の有頂端表面上の複数のモチル繊毛の同期的なメタクロナル拍動は、粘膜クリアランスまたはMCCを産生するセファラッド流を生成する。MCCは、PCD22のようなシリオパシーで危険にさらされ、COPD18のような病気を獲得し、その重要性は伝統的に繊毛症であるとは考えられてはいえないCHDで認識されている。最近のデータは、ヘテロタキシー23 とヘテロタキシー7のない両方のCHDで呼吸毛様機能不全を示している。このようなモチル繊毛機能不全は、より大きな呼吸症状9 ならびにより大きな術後罹患率8に変換することが示された。これらの疾患のほとんどは、すべてではないにしても、利用可能なマウスモデルを持っており、マウスのMCCを測定するためのプロトコルは、潜在的な治療法をテストするために利用できる貴重なツールです。
動物モデルは、病気を理解し、治療法の開発のための有用性を提供します。In vivo動物イメージングは、動物を犠牲にすることなく、同じ動物から複数のデータポイントを取得する機能を提供し、研究者が治療効果の研究と同様に病気の縦方向の経過をたどることを可能にする。MCCのマウスモデルは、複数の研究者によって数十年にわたって開発され、当初は平面シンチグラフィーを用いてビーグル犬に対して行われている、2次元核画像化技術24である。この技術は10年後にマウスでの使用に適応され、その後25,26の10年後にSPECTイメージングに適応した。マウスモデルにおけるこの技術の開発は、毛様体機能が大幅に変化するPCDのようなヒト疾患の複数のマウスモデルの入手可能性のために、この技術の関連性における大きな発展であった。MCCは、肺脱用および免疫抑制のマウスモデルにおいて評価されており、他のモデル19,26と組み合わせて使用される可能性を有する。CF、喘息、PCD、およびCHDに関連する繊毛症などの気道疾患を有するヒト患者におけるMCC測定試験が行われ、この技術が肺生理学および治療効果13の両方の研究を助けることができるという結果を生み出した。
このプロトコルの重要な部分は、正確な画像を定量化するために正しいイメージングパラメータを使用して取得を設定することです。SPECT取得設定を設計する際には、使用するコリメータ、回転あたりの射影数、回転ステップサイズなど、多くの要因が重要です。コリメータ選択は、取得の感度と分解能の主要な要因であり、そして取得設定は、使用されているコリメータ27に合わせて調整する必要がある場合があります。あるいは、ラットのような大きな動物を使用する場合、コリメーターを調整する必要があります。例えば複数のピンホールコリメータは、より敏感であるが、重なり合う突起を避けるためにステップサイズを選択する際には注意が必要であり、これは再構成アーティファクト25を引き起こす可能性のある画像のあいまいさを犠牲にして取得の感度をさらに高めることができる。再構成セットアップは、定量化可能な画像を生成する上でも重要です。MAP3Dは一般的に使用される反復再構成アルゴリズムであり、PSFは一般的な再構成モデルである。どちらもイメージの再構築に対して信頼性がありますが、反復回数とサブセット数を設定する際には注意が必要です。反復回数が多いほど、再構築に必要な計算時間が増加し、さらに増加するとリターンが減少して再構築の質が向上します。
ImageJ で画像を定量化するために使用する理想的な測定ツールは、選択範囲内のピクセルの合計値を出力する RawIntDen です。異なるサイズの肺ROI間でSPECTデータを定量化する場合、RawIntDenを使用すると、カウントの絶対的な尺度を提供し、平均測定が21と同様にROIの面積に対する測定の調整を回避します。
この手法には、この手法を適用する際に調査員が認識する必要がある、関連する多数のエラーの原因があります。注目すべきコンファウンダーは、麻酔薬の使用です。イオブルランは、マウスが取得完了後に急速に回復する速い作用、吸入麻酔薬です。しかし、マウスにケージ内で回復するのに十分な時間を与え、必要以上に麻酔を受けないように注意する必要があります。私たちの個人的な経験(未発表のデータ)では、0時間から6時間の間に吸入イオブルランを使用して麻酔を連続的に維持されたマウスは、無視できるクリアランスを示した。同様に、迅速な回復を確実にするためには、麻酔薬の制御用量も必要です。画像処理のために動物をパレットに固定する場合、人工物が肺と重ならないように、共同登録に使用される幻の管を胃の上に低く保つ必要があります。同様に、CT 画像の品質を確保するために、マウスから金属タグを取り除き、X線散乱からアーチファクトを避けるように注意してください。
現在のMCCプロトコルは無数の動物モデルに適用することができる。この技術は、スキャンされた動物の健康にごくわずかな影響を及ぼし、マウスによって十分に許容され、このため既に繊細なマウスの健康を危険にさらすことなく疾患モデルで使用することができる。この方法論の強さは、ビデオ顕微鏡のために気管を切除するために動物を犠牲にすることなく気道機能の一貫した反復可能な測定値を取得することを可能にするin vivo技術であることから来る、ex vivoモデルは26を必要とする。同じ動物の複数のスキャンで反復可能な測定を生成するこの技術の一貫性は、同じ動物が異なる薬剤または潜在的な治療で治療されることを可能にし、そして任意の動物モデルに内在する生物学的変動性を減少させるために同じ動物間で行われた統計的比較を可能にし、それによって統計的に有意な差を示すために必要なサンプルサイズを減少させる。
MCC技術を用いた気道機能の評価は、さまざまな動物モデルに調整し、気道の健康の多くの異なるモデルに適用するだけでなく、新しい治療法をテストすることができます。PCDのマウスモデルの気道は、この技術だけでなく、COPDのモデルを使用して評価することができます。また、一般的な臨床使用のMCCに対する様々な麻酔薬の差動効果を研究するためにも利用できます。最後に、このモデルを用いて、気道に対する治療剤の効果を評価することもできる。先に述べたように、繰り返しクマ, それはインビボ測定であるため、それは病気の過程で繰り返しMCC評価を可能にします, だけでなく、時間の経過と共に治療介入のテストの利点.さらに、マウスはヒト疾患を模倣/研究するために使用される最も一般的な実験動物であり、場合によっては、ヒト疾患の複数のトランスジェニックマウスモデルから選択できる。

繊毛は、藻類からヒトまでの進化史を通じて保存された微小管ベースの細胞小器官である。それらは細胞表面から発せられると多くの機能を有する1、局所的な環境感覚信号の認識から運動性、ヒトから初期の単細胞真核生物にまでさかのぼることができる機能2、3に至るまで。Ciliaは非運動性であり、環境信号を処理するセルの特殊なアンテナとして単一の役割を果たすことができます。またはモチルと倍数、同期して叩く、転移波は、卵管の内層や上下気道など流体の流れを発生させる、1、2に至る末端気管支を除く。
気道の広範な上皮表面は、潜在的に危険な汚染物質および病原体の形で汚染の絶え間ない集中砲火にさらされ、防御を必要とする。1つの重要な防御機構は気管気管支柱の粘液性装置であり、気管気管支上皮細胞の有端な表面を裏打ちする複数のモチル繊毛の叩きによって、分泌された粘液の連続的な流れが気道から機械的に運び出される。吸入された汚染物質を捕捉するこれらの機能、およびそれらの連続的な、同期の鼓動を通して、それらをセファルド4、5を輸送する。
繊毛は、胚発生における左右のパターン形成の発達などにおいて重要な役割を果たしていることが実証されており、胚節のモチル繊毛は対称性を破る6。繊毛関連遺伝子の変異は、心臓の非対称構造による先天性心疾患(CHD)などの疾患に関連している。最近の研究では、CHD患者の気道における毛様機能不全の発生率が高く、また、上気道および下部気道7、8、9、10における術後呼吸器合併症および慢性気道症状の有病率の増加が報告されている。CHDおよび毛様機能不全を有する患者は、ヘテロタキシーの有無にかかわらず、術後の呼吸合併症および陰性呼吸転帰のリスクが5、8、10に増加することが実証されている。シグナリングと発達における彼らの役割を超えて、気道繊毛の重要性は、主要な毛様体異形成(PCD)である毛様症によって実証されている。PCDは、運動性呼吸器繊毛に影響を及ぼす多数の突然変異に起因する先天性障害であり、再発性肺感染症、気管支拡張症、および肺移植の必要性を引き起こす可能性がある11。さらに、嚢胞性線維症(CF)において繊毛が正常であるにもかかわらず、白人集団において最も一般的な先天性障害は、CFTR遺伝子12の突然変異に起因する厚い粘膜粘液が厚いために障害される。PCDとCFの複数のマウスモデルと、CHDのモデルが増え続けています。最終的に繊毛は多くの重要な役割を持つ多目的な構造であり、生体内の運動性呼吸繊毛の機能を評価する方法は、前臨床研究に有用であり、突然変異および粘膜クリアランス(MCC)13に対する薬物の影響を評価する方法である。この方法は、これらのマウスモデルにおけるMCCに対する新規薬物、遺伝子治療または介入の影響を評価する上でも価値がある。
MCC の評価に使用されているさまざまなモデルがあります。1つの注目すべき方法は、気管支に植え付けられたメチレンブルー染料を使用することを含み、色素運動14の光ファイバー測定によって測定されたクリアランスを有する。この方法は、前臨床マウスモデルよりもヒトでより日常的である色素の動きを観察する能力によって制限される。もう一つの注目すべき方法は、放射光相対位X線イメージング(PCXI)であり、気道内の個々の粒子を追跡するために使用することができます。この方法は比較的新しく、広くアクセスできない15です。ビデオ顕微鏡用気管を切除することによって気道を評価する数多くのex vivo方法がありますが、これらのモデルはヒト患者16にはほとんど有用性を提供しません。光コヘレンス断層撮影などの繊毛イメージングの高解像度技術は、同じように17に制限されている。
本稿では、無数の動物モデルにおける肺クリアランスの測定に用いられてきたMCC in vivoを測定する再現性のある方法を提示するとともに、慢性閉塞性肺疾患におけるMCCの研究と免疫抑制薬18,19の効果を評価する。この方法は、肺への注入後に、不溶性微粒子放射性トレーサーである放射性医薬品99mテクネチウム硫黄コロイド(99mTc-Sc)のクリアランスを追跡する。放射性核種は、単一光子放出コンピュータ断層撮影(SPECT)18,20を使用して追跡することができる。我々は、肺への放射性同位元素数の共局在化とデュアルモダリティSPECTとコンピュータ断層撮影(CT)イメージングを使用して、6時間にわたってこれらのカウントの減少を測定することにより、MCCを測定するためのこの技術をさらに洗練しました。二重モダリティイメージングは、CT画像とSPECT画像の共登録により、対象領域である肺に対する放射線数の正確な局在化を可能にします。マウスにおけるMCC測定法については詳細に説明するが、プロトコルはラットのMCCを研究するように調整することができる。コリメーターは放射線量と同様に調整する必要があります。我々の見解では、マウスMCCスキャンは、小さな動物の大きさのために技術的に困難であるが、多くのヒト障害の確立されたマウスモデルの数が多いため、ラットよりも有用である。さらに、動物コロニーの低コストとメンテナンスコストのために、より大きなサンプルサイズはマウスでより実行可能です。

<table><tbody><tr><td>500 &amp;micro;m Unjacketed Fiber Optic Wire</td><td>Edmund Optics</td><td>02-532</td><td></td></tr><tr><td>99mTechnecium-Sulfur Colloid</td><td>Cardinal Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia Vaporizer</td><td>Vetland Medical</td><td>A13480</td><td></td></tr><tr><td>Durmont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>99150-20</td><td></td></tr><tr><td>FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65/1.52p Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Introcan Safety Catheters 20G 1inch</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1534477</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>118-2097</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Intubation Stand</td><td>Kent Scientific</td><td>ETI-MSE-01</td><td></td></tr><tr><td>Siemens Inveon dual-modality SPECT/CT</td><td>Siemens</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single Channel Anesthesia Stand</td><td>Summit Anesthesia Solutions</td><td>22860</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo evaluation of mucociliary clearance in mice

呼吸性繊毛は、細胞の専門の小器官であり、気道を裏打ちする上皮細胞の上端表面を並べる。メタクロナル、シンクロナル様式で殴打することにより、これらの複数の、運動性、アクチンベースのオルガネラは、吸入汚染物質および病原体の気道をクリアするセファラッド流体流れを生成する。環境汚染の増加に伴い、新しいウイルス病原体および新たな多剤耐性菌は、繊毛発生粘液性クリアランス(MCC)が肺の健康維持に不可欠である。MCCはまた、原発性毛様体異性症、嚢胞性線維症、ならびに慢性閉塞性肺疾患のような後天性障害のような複数の先天性疾患でうつ病である。これらすべての障害は、いくつかのケースでは、複数のマウスモデルを確立しています。本稿では、少量の放射能とデュアルモダリティSPECT/CTイメージングを用いて、生体内マウスのMCCを正確かつ再現的に測定する方法について詳述する。この方法は、イメージング後のマウスの回収を可能にし、連続測定を可能にし、時間の経過とともに長い間潜在的な治療薬をテストする。野生型マウスのデータは、細部に十分な注意が払われ、プロトコルが厳密に付着している限り、MCC測定の再現性を示す。

このプロトコルを用いて、イオブルランチャンバー内のマウスを麻酔した(図1A)。十分なレベルの麻酔を達成した後、マウスを垂直支持に置き(図1B)、発声コードを照らされたガイドワイヤーを使用して可視化した(図1C-1D)。マウスを挿管し、カニューレを介して10μLの体積で0.2 mCi 99mTc-Scを植え付け、マウスは肺に自発的に吸入することを許した(図1E-1F)。画像の取得と処理の後、CT画像とSPECT画像をランドマークとして使用して共局化した(図2A)。肺のマスクは、CT画像(図2C)から生成され、0(図2D)および6時間(図2E-2F)で分析するために右肺の周りにROIを描くために使用した。プロトコルの再現性をテストするために、同じ実験条件を持つ異なる日に合計8匹のマウスを2回スキャンし、繰り返しスキャンの間に有意な差を示さないペアのt検定を用いた分析(p値=0.9904)(図3A)。さらに2匹のマウスを同一の実験条件で異なる日に3回スキャンし、一方向ANOVAを用いた分析では、反復スキャン間の有意な一致を示す(図3B)。計8匹のマウスをスキャンし、2つの代表的な画像を表示した(図4)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig01.jpg"> 図1:マウス挿管と同位体の内挿。気道に同位体を挿管し、植え付けるために必要なステップの画像。 A) マウスはチャンバー内で麻酔を受ける。 B)麻酔マウスを垂直支持に置き、フロント切歯によって吊り下げ。 C)ガイドワイヤとして機能する光ファイバーワイヤを照射した0.5mmの光ファイバーワイヤーは、20 Gカニューレを通してそれを実行することによって準備されます。 D)マウスの口は鉗子を使って開き、照明付きガイドワイヤーを使って声帯を視覚化する。 E)カニューレは声帯を横切って押され、ガイドワイヤーは取り外される。 F)可溶性同位体はピペットを用いてカニューレに植え付け、マウスは自発的に同位体を肺に吸い込む。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig02v2.jpg"> 図 2: MCC スキャンの SPECT/CT イメージA) CT イメージと共にローカライズされた SPECT イメージ。 B)共局化に使用された可視幻のチューブを持つCT画像。 C)CT画像を二値化し、zスタックの合計投影を行うことによって導出される気道のマスク。 D)SPECT イメージと共にローカライズされた CT マスク。右肺の周囲に分析用のROIが描かれています。 E)6時間で気道のマスク。 F)分析用ROIと6時間の気道のCTおよびSPECTの共局化画像。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig03.jpg"> 図3:複数のスキャンで同じマウスのクリアランス測定。A)実験条件に変化のない8匹のマウスについて2個の反復クリアランスを測定した。ペアのt検定では、p値0.9904の繰り返しスキャンに有意な差がないことを示した。 B)実験条件に変化のない2匹のマウスについて3つの個別の反復クリアランスを測定した。一方向の分散分析は、p値0.0041の繰り返しスキャンの間に有意な一致があることを示した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig04.jpg"> 図4:右肺を概説する0時間と6時間でROIを描いた2匹のマウスにおける0時間および6時間の気道の共局化されたSPECT/CT画像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:呼吸効果を可視化した光ファイバーワイヤーで照らされた声帯の映像。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929supfig01.jpg" target="_blank">こちらをダウンロードしてください。</a>
補助ファイル。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/Supplemental_Files.zip" target="_blank">これらのファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice at JoVE.com

In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice

本稿では、二相様式放射性核種イメージングを利用したマウスの生体内における気道粘膜クリアランス(MCC)を評価するためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、デュアルSPECT/CTシステムでマウス全身(MWB)コリメータを使用した単一光子放射コンピュータ断層撮影(SPECT)およびコンピュータ断層撮影プロトコル用に設計されています。

マウスにおける粘膜クリアランスのインビボ評価

Respiratory motile cilia, specialized organelles of the cell, line the apical surface of epithelial cells lining the respiratory tract. By beating in a ...

in-vivo-evaluation-of-mucociliary-clearance-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

4.3K ビュー.  University of Pittsburgh School of Medicine. 本稿では、二相様式放射性核種イメージングを利用したマウスの生体内における気道粘膜クリアランス(MCC)を評価するためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、デュアルSPECT/CTシステムでマウス全身(MWB)コリメータを使用した単一光子放射コンピュータ断層撮影(SPECT)およびコンピュータ断層撮影プロトコル用に設計されています。

ビデオ: In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice

Murine Model of Allergen Induced Asthma

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, with the prevalence increasing.2 As with other diseases, animal models of allergic airway disease greatly facilitate understanding of the underlying pathophysiology, help identify potential therapeutic targets, and allow preclinical testing of possible new therapies. Models of allergic airway disease have been developed in several animal species, but murine models are particularly attractive due to the low cost, ready availability, and well-characterized immune systems of these animals.3 Availability of a variety of transgenic strains further increases the attractiveness of these models.4 Here we describe two murine models of allergic airway disease, both employing ovalbumin as the antigen. Following initial sensitization by intraperitoneal injection, one model delivers the antigen challenge by nebulization, the other by intratracheal delivery. These two models offer complementary advantages, with each mimicking the major features of human asthma.5
The major features of acute asthma include an exaggerated airway response to stimuli such as methacholine (airway hyperresponsiveness; AHR) and eosinophil-rich airway inflammation. These are also prominent effects of allergen challenge in our murine models,5,6 and we describe techniques for measuring them and thus evaluating the effects of experimental manipulation. Specifically, we describe both invasive7 and non-invasive8 techniques for measuring airway hyperresponsiveness as well as methods for assessing infiltration of inflammatory cells into the airways and the lung. Airway inflammatory cells are collected by bronchoalveolar lavage while lung histopathology is used to assess markers of inflammation throughout the organ. These techniques provide powerful tools for studying asthma in ways that would not be possible in humans.

Experimental mouse models of allergic asthma offer new possibilities for studying disease pathogenesis and developing new therapeutics. These models are well suited to measuring factors governing the allergic immune response, airway inflammation, and pulmonary pathophysiology.

アレルゲン誘発性喘息のマウスモデル

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

免疫・感染学

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly hydrated, forming a substantial endothelial surface layer (ESL) that contributes to the maintenance of endothelial function. As the endothelial glycocalyx is often aberrant in vitro and is lost during standard tissue fixation techniques, study of the ESL requires use of intravital microscopy. To best approximate the complex physiology of the alveolar microvasculature, pulmonary intravital imaging is ideally performed on a freely-moving lung. These preparations, however, typically suffer from extensive motion artifact. We demonstrate how closed-chest intravital microscopy of a freely-moving mouse lung can be used to measure glycocalyx integrity via ESL exclusion of fluorescently-labeled high molecular weight dextrans from the endothelial surface. This non-recovery surgical technique, which requires simultaneous brightfield and fluorescent imaging of the mouse lung, allows for longitudinal observation of the subpleural microvasculature without evidence of inducing confounding lung injury.

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx/endothelial surface layer is ideally studied using intravital microscopy. Intravital microscopy is technically challenging in a moving organ such as the lung. We demonstrate how simultaneous brightfield and fluorescent microscopy may be used to estimate endothelial surface layer thickness in a freely-moving in vivo mouse lung.

マウス肺内皮表面層の in vivo測定における

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

医学

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen interactions take advantage of intraperitoneal injections of select bacteria or pathogen associated molecular patterns (PAMPs) in mice. While these techniques have yielded tremendous data associated with infectious disease pathobiology, intraperitoneal injection models are not always appropriate for host-pathogen interaction studies in the lung. Utilizing an acute lung inflammation model in mice, it is possible to conduct a high resolution analysis of the host innate immune response utilizing lipopolysaccharide (LPS). Here, we describe the methods to administer LPS using nonsurgical oropharyngeal intratracheal administration, monitor clinical parameters associated with disease pathogenesis, and utilize bronchoalveolar lavage fluid to evaluate the host immune response. The techniques that are described are widely applicable for studying the host innate immune response to a diverse range of PAMPs and pathogens. Likewise, with minor modifications, these techniques can also be applied in studies evaluating allergic airway inflammation and in pharmacological applications.

The host immune response to pathogen infection is a tightly regulated process. Utilizing a lipopolysaccharide lung exposure model in mice, it is possible to conduct high resolution evaluations of the complex mechanisms associated with disease pathogenesis.

マウスにおける宿主の免疫応答を評価する口腔咽頭気管内PAMP管理および気管支肺胞の活用

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

A Reversible, Non-invasive Method for Airway Resistance Measurements and Bronchoalveolar Lavage Fluid Sampling in Mice

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated procedures to obtain such measurements in the same animal are generally not feasible.  Here, we demonstrate protocols for obtaining from mice repeated measurements of AHR and bronchoalveolar lavage fluid samples.  Mice were challenged intranasally seven times over 14 days with a potent allergen or sham treated.  Prior to the initial challenge, and within 24 hours following each intranasal challenge, the same animals were anesthetized, orally intubated and mechanically ventilated.  AHR, assessed by comparing dose response curves of respiratory system resistance (RRS) induced by increasing intravenous doses of acetylcholine (Ach) chloride between sham and allergen-challenged animals, were determined.  Afterwards, and via the same intubation, the left lung was lavaged so that differential enumeration of airway cells could be performed.  These studies reveal that repeated measurements of AHR and BAL fluid collection are possible from the same animals and that maximal airway hyperresponsiveness and airway eosinophilia are achieved within 7-10 days of initiating allergen challenge.  This novel technique significantly reduces the number of mice required for longitudinal experimentation and is applicable to diverse rodent species, disease models and airway physiology instruments.  

Repeated measurements of rodent respiratory physiology and sampling of airway inflammatory cells are desirable, but generally not feasible. Here we describe a repeatable method for orally intubating mice that permits repeated measurements of airway hyperreactivity and sampling of airway inflammatory cells.

気道抵抗測定とマウスにおける気管支肺胞洗浄液のサンプリングのためのリバーシブル、非侵襲的方法

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated ...

生物学

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

微生物群集を学びます<em&gt;インビボ</em&gt;：ホスト間の媒介の相互作用のモデル<em&gt;カンジダ</em&gt;と<em&gt;緑膿菌</em&gt;航空で

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

The forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational tool permitting the experimental assessment of lung function in mice in a comprehensive, detailed, precise and reproducible manner. It provides measurements of respiratory system mechanics through the analysis of pressure and volume signals acquired in reaction to predefined, small amplitude, oscillatory airflow waveforms, which are typically applied at the subject's airway opening. The present protocol details the steps required to adequately execute forced oscillation measurements in mice using a computer-controlled piston ventilator (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada). The description is divided into four parts: preparatory steps, mechanical ventilation, lung function measurements, and data analysis. It also includes details of how to assess airway responsiveness to inhaled methacholine in anesthetized mice, a common application of this technique which also extends to other outcomes and various lung pathologies. Measurements obtained in na&iuml;ve mice as well as from an oxidative-stress driven model of airway damage are presented to illustrate how this tool can contribute to a better characterization and understanding of studied physiological changes or disease models as well as to applications in new research areas.

The present protocol provides a detailed step-by-step description of the procedures required to execute measurements of respiratory system mechanics as well as the assessment of airway responsiveness to inhaled methacholine in mice using the forced oscillation technique (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada).

強制振動法を用いたマウスにおける呼吸器系の力学の評価

The  forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational  tool permitting the experimental assessment of lung function in mice ...

Assessment of Respiratory Function in Conscious Mice by Double-chamber Plethysmography

Air volume changes created by a conscious subject breathing spontaneously within a body box are at the basis of plethysmography, a technique used to non-invasively assess some features of the respiratory function in humans as well as in laboratory animals. The present article focuses on the application of the double-chamber plethysmography (DCP) in small animals. It provides background information on the methodology as well as a detailed step-by-step procedure to successfully assess respiratory function in conscious, spontaneously breathing animals in a non-invasive manner. The DCP can be used to monitor the respiratory function of multiple animals in parallel, as well as to identify changes induced by aerosolized substances over a chosen time period and in a repeated manner. Experiments on control and allergic mice are used herein to demonstrate the utility of the technique, explain the associated outcome parameters, as well as to discuss the related advantages and shortcomings. Overall, the DCP provides valid and theoretically sound readouts that can be trusted to evaluate the respiratory function of conscious small animals both at baseline and after challenges with aerosolized substances.

The objective of the present article is to provide a detailed description of the recommended procedures to evaluate respiratory function in conscious mice by double-chamber plethysmography.

ダブル室容積脈波による意識下マウスにおける呼吸機能の評価

Air volume changes created by a conscious subject breathing spontaneously within a body box are at the basis of plethysmography, a technique used to ...

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary clearance function has been established. Freshly harvested mouse trachea is cut longitudinally through the trachealis muscle and mounted in a shallow walled chamber on a glass-bottomed dish. The trachea sample is positioned along its long axis to take advantage of the trachealis muscle to curl longitudinally. This allows imaging of ciliary motion in the profile view along the entire tracheal length. Videos at 200 frames/sec are obtained using differential interference contrast microscopy and a high speed digital camera to allow quantitative analysis of cilia beat frequency and ciliary waveform. With the addition of fluorescent beads during imaging, cilia generated fluid flow also can be determined. The protocol time spans approximately 30 min, with 5 min for chamber preparation, 5-10 min for sample mounting, and 10-15 min for videomicroscopy.

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An easy and reliable technique for visualizing and quantifying airway cilia motility and cilia generated flow using mouse trachea is described. This technique can be modified to determine how a wide range of factors influence cilia motility, including pharmacological agents, genetic factors, environmental exposures, and/or mechanical factors such as mucus load.

齧歯気道上皮における繊毛の運動性の高分解能イメージングのためのex vivo法

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful in cases of attenuated, oligo- or mono-symptomatic forms of CF usually diagnosed later in life, and of CF-related disorders such as congenital bilateral absence of vas deferens, idiopathic chronic pancreatitis, allergic bronchopulmonary aspergillosis, and bronchiectasis. In both clinical and preclinical settings, the test has been used as a biomarker to quantify responses to targeted therapeutic strategies for CF. Adapting the test to a mouse is challenging and can entail an associated mortality. This paper describes the adequate depth of anesthesia required to maintain a nasal catheter in situ for continuous perfusion. It lists measures to avoid broncho-aspiration of solutions perfused in the nose. It also describes the animal care at the end of the test, including administration of a combination of antidotes of the anesthetic drugs, leading to rapidly reversing the anesthesia with full recovery of the animals. Representative data obtained from a CF and a wild-type mouse show that the test discriminates between CF and non-CF. Altogether, the protocol described here allows reliable measurements of the functional status of trans-epithelial chloride and sodium transporters in spontaneously breathing mice, as well as multiple tests in the same animal while reducing test-related mortality.

Here, we present a protocol to measure nasal potential difference in mice. The test quantifies the function of transmembrane ion transporters such as the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and the epithelial sodium channel. It is valuable to evaluate the efficacy of novel therapies for cystic fibrosis.

マウスにおける上皮細胞のイオン輸送を定量化する鼻の潜在的な違い

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

マウスの咳過敏症に対する非侵襲的リアルタイム全身プレチスモグラフィー

Methods for Detecting Cough and Airway Inflammation in Mice

Chronic cough, which lasts for more than 8 weeks, is one of the most common complaints requiring medical attention, and patients suffer from a huge socioeconomic burden and a marked decrement in quality of life. Animal models can mimic the complex pathophysiology of the cough and are important tools for cough research. The detection of cough sensitivity and airway inflammation is of great significance for studying the complex pathological mechanism of cough. This article describes the measurement of cough using a noninvasive and real-time whole-body plethysmography (WBP) system and the normative procedures for harvesting tissue samples (including blood, lung, spleen, and trachea) of mice. It introduces some methods to assess airway inflammation, including pathological changes in hematoxylin and eosin (HE)-stained lung and trachea sections, the total protein concentration, the uric acid concentration, and the lactate dehydrogenase (LDH) activity in the supernatant of bronchoalveolar lavage fluid (BALF), and the leukocytes and differential cell counts of BALF. These methods are reproducible and serve as valuable tools to study the complex pathophysiology of cough.

著者スポットライト:慢性咳嗽の病態生理学の調査

Here, we describe the measurement of cough using a noninvasive and real-time whole-body plethysmography (WBP) system and the normative procedures for harvesting tissue samples of mice and introduce some methods to assess airway inflammation.

マウスにおける咳嗽および気道炎症の検出方法

Chronic cough, which lasts for more than 8 weeks, is one of the most common complaints requiring medical attention, and patients suffer from a huge ...