M.Z. und K.S.F. und diese Arbeit wurde durch ein Stipendium unterstützt, das im Rahmen der Pitt Innovation Challenge (PInCh) durch das Clinical and Translational Science Institute der University of Pittsburgh und das NHLBI R01 Grant HL153407 an M.Z. vergeben wurde.

Der Institutional Animal Care and Use Committee der University of Pittsburgh genehmigte alle in dieser Veröffentlichung aufgeführten Tierprotokolle, bevor er eines dieser Tierversuche durchführte.
HINWEIS: In diesem Protokoll wird erläutert, wie in vivo mukociliäre Clearance-Studien unter Verwendung von Radionuklid-Bildgebung mit einem SPECT/CT-Scanner mit doppelter Modalität durchgeführt werden. Die gezeigten Techniken sind das Laufen von Systemkalibrierungen, die Anästhesisierung von Mäusen, die Trachealintubation von Mäusen, das Einflößen des Isotops in die Lunge, dualmodale Bildgebung, Die Koregistrierung dieser Bilder und die Analyse.
1. SPECT/CT System-Setup
<ol><li>Entwerfen Sie einen geeigneten Workflow und richten Sie sie vor der Durchführung von Experimenten mit lebenden Tieren ein.<ol>
<li>Verwenden Sie eine SPECT-Erfassung, die aus 60 Projektionen mit einer Schrittgröße von 6o zwischen den Projektionen mit einem Drehradius von 40 cm besteht. Die CT-Erfassung besteht aus 220 Projektionen mit einem Winkel von 1,6o zwischen den Projektionen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass das System über die richtigen MWB-Kollimatoren für Mäuse und SPECT-Bildgebung verfügt. Wenn die ungeeigneten Kollimatoren installiert sind, installieren Sie die richtigen Kolimmator-Assistenten.</li>
	<li>Führen Sie die erforderlichen Systemkalibrierungen aus, um das System für den Einsatz vorzubereiten. HINWEIS: Die SPECT- und CT-Komponenten des Scanners müssen kalibriert werden. Kalibrieren Sie die CT-Komponenten einmal täglich mit einer Quellkonditionierung und einer Dark/Light (D/L)-Kalibrierung, alle 2 Wochen eine Center Offset (COS)-Kalibrierung und bewerten Sie die Röntgenhardware jeden Monat. Die SPECT-Komponenten müssen einmal im Jahr kalibriert werden.<ol>
<li>Um die Röntgenhardware auszuwerten, aktivieren Sie das Feld Röntgenhardware auswerten während der CT-Kalibrierung (Supplemental CT Calibration Menu).</li>
		<li>Um die Quellkonditionierung durchzuführen, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Quellkonditionierung während der CT-Kalibrierungen durchführen (Supplemental CT Calibration Menu).</li>
		<li>Um eine D/L-Kalibrierung durchzuführen, aktivieren Sie das D/L-Feld neben dem CT-Erfassungsprotokoll, das bei Experimenten während CT-Kalibrierungen verwendet wird. Deaktivieren Sie alle anderen Protokolle (Ergänzendes CT-Kalibrierungsmenü).</li>
		<li>Um eine COS-Kalibrierung durchzuführen, ersetzen Sie das Bett durch das Kalibrierringwerkzeug, passen Sie die Bettentypeinstellungen an die Bewegungssteuerungseinstellungen an, und aktivieren Sie das COS-Feld neben dem CT-Erfassungsprotokoll, das bei Experimenten während CT-Kalibrierungen verwendet wird. Deaktivieren Sie alle anderen Protokolle (Ergänzendes CT-Kalibrierungsmenü, Ergänzungskalibrierungsring).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Mausintubation und Instillation
<ol><li>Wiegen Sie die zu scannenden Mäuse. Wenn Sie mehrere Mäuse scannen, achten Sie darauf, die Mäuse zu Identifikationszwecken mit Methoden wie Ohrstanzen oder Markierung des Schwanzes zu markieren.</li>
	<li>Anästhetisieren Sie eine Maus mit 1,5% Isofluran emit einem Gasstrom von 2 L/minO2 in einer Gaskammer für 5 Minuten, um eine Anästhesie von ausreichender Tiefe zu erzeugen, bis sich die Atmung auf 55-65 Atemzüge pro Minute verlangsamt 16 (Abbildung 1A).</li>
	<li>Entfernen Sie die Maus aus der Kammer und hängen Sie durch die vorderen Schneidezähne an einem Intubationsständer bei einer Steigung von 45o. Rüsten Sie den Intubationsständer mit einem Nasenkegel aus, um sicherzustellen, dass die Maus während der Intubation befruchtet wird (Abbildung 1B).</li>
	<li>Schließen Sie ein Ende eines 50-mm-Glasfaserdrahts an eine Lichtquelle an und fädeln Sie eine 20-Spur-Kanüle darüber, indem Sie den Draht als Führungslinie verwenden (Abbildung 1C).</li>
	<li>Öffnen Sie den Mund der Maus und ziehen Sie die Zunge mit stumpfer Zange nach vorne. Beleuchten Sie den Führungsdraht und verwenden Sie ihn, um die Stimmbänder zu visualisieren (Abbildung 1D).</li>
	<li>Passieren Sie den Führungsdraht durch die Stimmbänder, so dass der Draht direkt hinter den Stimmbändern liegt und in der oberen Luftröhre ruht. Schieben Sie die 1 Zoll Kanüle entlang des Drahtes nach vorne, um die Maus zu intubieren, und passieren Sie die Kanüle tief genug, so dass die Nabe davon gegen die Schneidezähne des Tieres ist (Abbildung 1E). Entfernen Sie den Draht, der die Kanüle an Ort und Stelle lässt.</li>
	<li>Testen Sie die Intubation, indem Sie die Kanüle kurz mit einem Finger verstopfen und auf Atemänderungen überprüfen. Angehaltene Atmung oder angespannte Atmung während des Verstopfens und beschleunigte Atmung bei der Freisetzung sind Anzeichen einer richtigen Trachealintubation. Wenn es keine Änderung der Atemwege beim Verstopfen der Kanüle gibt, ist letztere wahrscheinlich in der Speiseröhre.</li>
	<li>Bereiten Sie 0,2 mCi von 99mTechnetium-Schwefelkolloid (99mTc-Sc) in einem Volumen von 10 l und Pipette in die Kanüle vor. Lassen Sie die Maus spontan in die Lunge über 1-2 min einatmen (Abbildung 1F). Entfernen Sie die Kanüle, bevor Sie die Maus auf die Palette des Scanners übertragen. HINWEIS: Das Radionuklid wurde von Cardinal Health vorbereitet und gefiltert.</li>
</ol>3. SPECT/CT-Bildgebung
<ol><li>Übertragen Sie die Maus auf eine 25-mm-Palette mit einem Nasenkegel und sichern Sie mit Klebeband, wobei darauf zu achten ist, Brust und Bauch nicht zu fest zu kleben, um eine Beeinträchtigung der Atmung zu vermeiden. Achten Sie darauf, alle Anstriche aus Metall zu entfernen, die an der Maus befestigt sind.</li>
	<li>Bereiten Sie ein radioaktives Phantom bestehend aus 0,05 mCi in 200 l vor und legen Sie diese Menge in ein 0,2 ml PCR-Rohr. Positionieren Sie das Rohr, indem Sie sich auf die Palette unter dem Unterbauch der Maus kleben, um Überlappungen mit der Lunge zu vermeiden. HINWEIS: Das Phantom wird zum Zwecke der Ko-Registrierung von CT- und SPECT-Bildern sowie einer Negativkontrolle für die Räumung verwendet.</li>
	<li>Legen Sie die Maus in das SPECT/CT-System ein, wählen Sie den Imaging-Workflow aus, und führen Sie Setup aus.</li>
	<li>Richten Sie die Positionierung der Detektoren auf der Maus ein, und führen Sie den Imaging-Workflow aus.</li>
	<li>Bereiten Sie einen Käfig für Mäuse vor, die nach dem Eingriff Radioaktivität erhalten haben, mit uneingeschränktem Zugang zu Nahrung und Wasser und klarer Kennzeichnung mit einem Strahlenschutzaufkleber.</li>
	<li>Entfernen Sie nach Abschluss des Workflows die Maus von der Bildpalette, und lassen Sie sie im vorbereiteten Käfig für eine Dauer von 6 Stunden zwischen den Scans (Ende von Scan 1 bis Anfang des Scans 2) mit ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser wiederherstellen. 6 h wurde gewählt, da es dem Zeitraum entspricht, in dem die lineare Clearance je nach Zilienfunktion mit sehr wenig Alveolarabstand stattfindet.</li>
	<li>Nach 6 Stunden, re-anästhetisieren Sie die Maus und scannen, zusammen mit dem Phantom, mit dem gleichen Workflow, um die Menge an Isotop aus den Atemwegen gelöscht zu messen. HINWEIS: Es ist wichtig, dass sich die Maus 6 Stunden lang erholen kann, da eine ununterbrochene Anästhesie mit Isofluran zu einer signifikanten ziliendepressierenden Wirkung führt, die zu fast Null-Mukociliärabständen führt.</li>
</ol>4. Analyse
<ol><li>Führen Sie nach der Bildgebung eine Nachbearbeitung durch, um vollständige 3D-Stack-Images zu rekonstruieren.<ol>
<li>Histogramm die SPECT-Bilder mit den Werksstandardeinstellungen für 99mTc, und dann rekonstruieren mit einem MAP3D-Algorithmus und Punkt-Spread-Funktion (PSF) Rekonstruktion. HINWEIS: Die Rekonstruktion wurde mit 8 Iterationen und 6 Teilmengen durchgeführt. Eine effektive Rekonstruktion erfordert ein Verhältnis von Teilmengen zu Projektionen bei 1:10 oder gleichmäßig in die Anzahl der Projektionen aufzuteilen, so dass 6 Teilmengen aufgrund der Erfassung mit 60 Projektionen verwendet wurden.</li>
		<li>Rekonstruieren Sie die CT-Bilder mit dem Feldkamp-Algorithmus und einem Shepp-Logan-Filter. HINWEIS: Die Rekonstruktion wurde mit 4 Iterationen durchgeführt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verarbeiten Sie die CT- und SPECT-Bilder in FIJI ImageJ21 mit dem Werkzeug Reslice, um koronale Ansichtsbilder aus den standardmäßigen axialen Bildern zu generieren. Führen Sie dann eine Z-Stack-Summenprojektion auf dem SPECT-Bild aus, um die Zähldaten aus jedem Slice hinzuzufügen und ein einzelnes Bild zu generieren, um die Analyse zu vereinfachen.</li>
	<li>Ändern und Registrieren der CT- und SPECT-Bilder mit der Phantom-Eppendorf-Röhre als Referenz (Abbildung 2A,B). Verfolgen und verwenden Sie konsistente Größengrößenmessungen für alle Proben.</li>
	<li>Binarisieren Sie das CT-Bild mithilfe der automatischen Schwellenwertierung, gefolgt von der Umkehr des Stapels und der Durchführung einer Z-Stack-Summenprojektion, um einen Umriss der Lunge für die Analyse zu generieren (Abbildung 2C).</li>
	<li>Drehen Sie die CT- und SPECT-Bilder, und führen Sie das Bild mit den Kanalwerkzeugen zusammen. Berechnen Sie MCC, indem Sie einen ROI um die rechte Lunge zeichnen und messen (Abbildung 2D). ANMERKUNG: Diese Messung wird die Gesamtzahl der Werte in der rechten Lunge für die 0- und 6-Stunden-Zeitpunkte sein, wobei die 6-Stunden-Bilder für radioaktiven Zerfall mit der Formel korrigiert werden: N(t) = N0e.t. 99m Tc-Sc hat eine Zerfallskonstante von 3,21e5 pro Sekunde bei einer Halbwertszeit von 6 Stunden. Diese Werte können dann verwendet werden, um einen prozentualen Abstand zu berechnen. HINWEIS: Die rechte Lunge wird für die ROI-Zeichnung und Messanzahl ausgewählt, da die Mukociliaary Clearance das Radioisotop aus der Lunge zum Rachen transportiert, von wo es geschluckt wird und im Magen landet. Sehr häufig können Zählungen im Magen gesehen werden, die sich mit der linken Lunge überlappen und somit fehlerhafte Zählungen erzeugen können. Diese Verwechslung kann vermieden werden, indem die Zählungen nur in der rechten Lunge gemessen werden.</li>
</ol>

<ol>
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Keiner hat mit dieser Arbeit zu tun.

Die Rolle der motilen Respirator Zilien bei Krankheiten und Entwicklung entwickelt sich weiter und wird besser geschätzt. Synchrones, metachronales Schlagen mehrerer motiler Zilien auf der apikalen Oberfläche von Zellen, die den tracheobronchiale Baum aussäen, erzeugen cephaladen Fluss, der eine mukociliäre Clearance oder MCC erzeugt. MCC ist in Ciliopathien wie PCD22kompromittiert, erworbene Krankheiten wie COPD18, und seine Bedeutung wird in CHDs erkannt, die traditionell nicht als Ciliopathien angesehen werden. Jüngste Daten haben gezeigt, dass die Ziliarfunktionsstörung der Atemwege sowohl bei DER CHD mit Heterotaxy23 als auch ohne Heterotaxie7aufgetreten ist. Eine solche motile Ziliendysfunktion wurde gezeigt, in größere Atemwegssymptome zu übersetzen9 sowie größere postoperative Morbidität8. Die meisten, wenn nicht alle dieser Krankheiten, haben Mausmodelle zur Verfügung und unser Protokoll zur Messung von MCC bei Mäusen ist ein wertvolles Werkzeug, das verwendet werden kann, um potenzielle Therapeutika zu testen.
Tiermodelle liefern Nutzen für das Verständnis von Krankheiten und die Entwicklung von Therapien. In vivo Tierbildbietet weitere Nützlichkeit mit der Fähigkeit, mehrere Datenpunkte von den gleichen Tieren zu erfassen, ohne die Notwendigkeit, die Tiere zu opfern, so dass die Forscher Längsverlauf der Krankheit zu folgen sowie die Dauer der Behandlungseffekte zu studieren. Das Mausmodell von MCC wurde im Laufe von Jahrzehnten von mehreren Forschern entwickelt, zunächst an Beagle-Hunden mit planarer Szintigraphie durchgeführt, einer zweidimensionalen nuklearenBildgebungstechnik 24. Die Technik wurde für den Einsatz bei Mäusen ein Jahrzehnt später angepasst, gefolgt von der Anpassung an SPECT Bildgebung ein Jahrzehnt später25,26. Die Entwicklung dieser Technik in Mausmodellen war eine wichtige Entwicklung in der Relevanz dieser Technik, aufgrund der Verfügbarkeit von mehreren Mausmodellen menschlicher Krankheiten wie PCD, bei denen die Ziliarfunktion signifikant verändert wird. MCC wurde in Mausmodellen der Lungendenervation und Immunsuppression bewertet und hat das Potenzial, in Verbindung mit anderen Modellen19,26verwendet zu werden. MCC-Messstudien an menschlichen Patienten mit Atemwegserkrankungen wie CF, Asthma, PCD und Ciliopathien im Zusammenhang mit CHD wurden durchgeführt und haben Ergebnisse erbracht, dass die Technik sowohl Studien der Lungenphysiologie als auch der therapeutischen Wirksamkeit unterstützen kann13.
Ein wichtiger Teil dieses Protokolls ist das Einrichten von Erfassungen mit den richtigen Bildparametern, um genaue Bilder für die Quantifizierung zu erfassen. Eine Reihe von Faktoren sind entscheidend beim Entwerfen von SPECT-Erfassungseinstellungen, einschließlich der verwendeten Kollimatoren, der Anzahl der pro Umdrehung zu erfassenden Projektionen und der Rotationsschrittgröße. Die Auswahl des Kollimators ist ein wichtiger Faktor für die Empfindlichkeit und Auflösung der Erfassung, und die Erfassungseinstellungen müssen möglicherweise auf den verwendeten Kollimator zugeschnitten werden27. Alternativ müssten bei der Verwendung größerer Tiere wie Ratten die Kollimatoren angepasst werden. Mehrere Lochkollimatoren zum Beispiel sind empfindlicher, aber bei der Auswahl einer Schrittgröße sollte Vorsicht geboten sein, um überlappende Projektionen zu vermeiden und unerwünschtemultiples Multiplexing zu verursachen, was die Empfindlichkeit der Erfassung auf Kosten einer Bildmehrdeutigkeit, die Rekonstruktionsartefakte verursachen kann, weiter erhöhen kann25. Die Rekonstruktionseinrichtung ist auch der Schlüssel, um quantifizierbare Bilder zu generieren. MAP3D ist ein häufig verwendeter iterativer Rekonstruktionsalgorithmus, und PSF ist ein gemeinsames Rekonstruktionsmodell. Beide sind zuverlässig für die Rekonstruktion von Bildern, aber beim Festlegen der Anzahl der Iterationen und Teilmengen sollte Vorsicht geboten sein. Eine höhere Anzahl von Iterationen erhöht die Rechenzeit, die für die Rekonstruktion benötigt wird, und erhöht die Qualität der Rekonstruktion mit abnehmenden Erträgen bei weiterer Erhöhung.
Um Bilder in ImageJ zu quantifizieren, ist RawIntDen das ideale Messwerkzeug, das den Summenwert von Pixeln in einer Auswahl ausgibt. Bei der Quantifizierung von SPECT-Daten über Lungen-ROIs unterschiedlicher Größe bietet die Verwendung von RawIntDen ein absolutes Maß für die Anzahl und vermeidet eine Anpassung der Messung an den Bereich des ROI, wie die mittlere Messung21.
Diese Technik hat eine Reihe von zugeordneten Fehlerquellen, die der Prüfer bei der Anwendung dieser Technik kennen sollte. Ein bemerkenswerter Konstifter ist die Verwendung von Anästhetika. Isoflurane ist ein schnell wirkendes, inhaliertes Anästhetikum, von dem sich die Mäuse nach Abschluss einer Erfassung schnell erholen. Es sollte jedoch darauf geachtet werden, den Mäusen genügend Zeit zu geben, sich in ihren Käfigen zu erholen, und nicht länger als nötig befruchtet zu halten. In unserer persönlichen Erfahrung (unveröffentlichte Daten) zeigten Mäuse, die kontinuierlich mit inhaliertem Isofluran zwischen dem 0- und 6-Stunden-Zeitpunkt anästhesiend gehalten wurden, eine vernachlässigbare Clearance. Ebenso ist eine kontrollierte Dosis an Anästhetikum notwendig, um eine schnelle Genesung zu gewährleisten. Bei der Sicherung des Tieres auf der Palette für die Bildgebung sollte das Phantomrohr, das für die Mitregistrierung verwendet wird, auf dem Magen niedrig gehalten werden, um zu vermeiden, dass sich Artefakte mit der Lunge überlappen. Um ein hochwertiges CT-Bild zu gewährleisten, achten Sie darauf, Metall-Tags von der Maus zu entfernen, um Artefakte aus der Röntgenstreuung zu vermeiden.
Das aktuelle MCC-Protokoll kann auf unzählige Tiermodelle angewendet werden. Diese Technik hat eine vernachlässigbare Wirkung auf die Gesundheit des gescannten Tieres, wird von Mäusen gut vertragen und kann daher mit Krankheitsmodellen verwendet werden, ohne die Gesundheit bereits empfindlicher Mäuse zu gefährden. Die Stärke dieser Methode ergibt sich aus einer In-vivo-Technik, die den Erwerb konsistenter und wiederholbarer Messungen der Atemwegsfunktion ohne das Opfer von Tieren ermöglicht, Tracheas für die Videomikroskopie zu verbrauchen, die ex vivo-Modelle26erfordern. Die Konsistenz dieser Technik bei der Erstellung wiederholbarer Messungen bei mehreren Scans derselben Tiere ermöglicht es, dasselbe Tier mit verschiedenen Wirkstoffen oder potenziellen Therapeutika zu behandeln, und statistische Vergleiche zwischen demselben Tier, um die biologische Variabilität eines Tiermodells zu verringern, wodurch die Stichprobengröße verringert wird, die erforderlich ist, um statistisch signifikante Unterschiede aufzuzeigen.
Die Beurteilung der Atemwegsfunktion mit der MCC-Technik kann an eine Vielzahl von Tiermodellen angepasst und auf viele verschiedene Modelle der Atemwegsgesundheit angewendet werden, sowie neue Therapien testen. Die Atemwege von Mausmodellen von PCD können mit dieser Technik bewertet werden, sowie Modelle von COPD. Unsere Methode kann auch verwendet werden, um Differentialeffekte von verschiedenen Anästhetika auf MCC zu studieren, die im allgemeinen klinischen Einsatz sind. Schließlich können auch die Wirkungen von therapeutischen Wirkstoffen auf die Atemwege anhand dieses Modells beurteilt werden. Wie bereits erwähnt, aber trägt Wiederholung, da es sich um eine In-vivo-Messung ermöglicht es für die Wiederholung MCC-Bewertungen im Verlauf einer Krankheit, sowie Test-Vorteile der therapeutischen Interventionen im Laufe der Zeit. Darüber hinaus sind Mäuse die häufigsten Labortiere, die verwendet werden, um menschliche Krankheiten nachzuahmen/zu studieren, wobei in einigen Fällen mehrere transgene Mausmodelle menschlicher Krankheiten zur Auswahl stehen.

Cilia sind mikrotubuliebasierte Zellorganellen, die in der Evolutionsgeschichte von Algen bis zum Menschen konserviert werden. Sie stammen von Zelloberflächen und haben eine Reihe von Funktionen1, von der Erkennung lokaler Umweltsensorsignale bis zur Beweglichkeit, Funktionen, die vom Menschen bis zu frühen einzelligen eukaryotischen Organismen zurückverfolgt werden können2,3. Cilia kann nicht-motile und Single dienen als spezialisierte Antenne einer Zelle, um Umweltsignale zu verarbeiten; oder motile und mehrfach, schlagen in synchronisierten, metachronalen Wellen, um Flüssigkeitsfluss zu erzeugen, wie in der Auskleidung der Eileiter und der oberen und unteren Atemwege, mit Ausnahme der Terminal Bronchiole, die zu den Alveolenführen 1,2.
Die ausgedehnte Epitheloberfläche der Atemwege ist einer ständigen Kontamination in Form einer Vielzahl potenziell gefährlicher eingeatmeter Schadstoffe und Krankheitserreger ausgesetzt, was eine Verteidigung erforderlich macht. Ein wichtiger Abwehrmechanismus ist der Mukociliarapparat des Tracheobronchialbaumes, bei dem ein kontinuierlicher Fluss von abgesondertem Schleim durch das Schlagen mehrerer motiler Zilien, die die apikalen Oberflächen der Tracheo-Bronchialepithelzellen säumen, mechanisch aus der Atemwege transportiert wird. Diese funktionieren, um eingeatmete Verunreinigungen einzufangen, und durch ihre kontinuierliche, synchrone Schläge, transportieren sie cephalad4,5.
Cilia hat nachweislich Schlüsselrollen, wie z. B. bei der Entwicklung von Links-Rechts-Mustern bei der Entwicklung von Embryonen, bei denen motile Zilien am embryonalen Knoten Symmetrie brechen6. Mutationen in Zilien-bezogenen Genen wurden aufgrund der asymmetrischen Struktur des Herzens mit Krankheiten wie angeborenen Herzerkrankungen (CHD) in Verbindung gebracht6. Jüngste Studien haben eine hohe Inzidenz von Ziliarfunktionsstörungen in den Atemwegen von Patienten mit CHD berichtet, sowie eine erhöhte Prävalenz von postoperativen Atemwegskomplikationen und chronischen Atemwegssymptomen in den oberen und unteren Atemwegen7,8,9,10. Patienten mit CHD und Ziliarfunktionsstörungen, mit oder ohne Heterotaxie, haben nachweislich ein erhöhtes Risiko für Atemwegskomplikationen und negative Atemfolgen postoperativ5,8,10. Über ihre Rolle bei der Signalisierung und Entwicklung hinaus wurde die Bedeutung der Atemwegszilailia durch Ciliopathien demonstriert, von denen ein Paradebeispiel die primäre Ziliardyskinesie (PCD) ist. PCD ist eine angeborene Erkrankung, die aus einer Reihe von Mutationen resultiert, die die motile Respiratil-Zilien beeinflussen, was zu wiederkehrenden Lungeninfektionen, Bronchiektase und potenziell der Notwendigkeit einer Lungentransplantation11führt. Darüber hinaus, obwohl Zilien sind normal bei Mukoviszidose (CF), häufigste angeborene Störung in der kaukasischen Bevölkerung, MCC ist durch dicken, zähflüssigen Schleim infolge von Mutationen im CFTR-Gen12beeinträchtigt. Es gibt mehrere Mausmodelle von PCD und CF, sowie eine ständig wachsende Anzahl von Modellen von CHD. Letztlich sind Zilien vielseitige Strukturen mit vielen Schlüsselrollen, und eine Methode zur Beurteilung der Funktion der motilen Atemwegszilien in vivo kann für präklinische Studien wertvoll sein, und die Bewertung der Auswirkungen von Mutationen sowie Medikamenten auf die mukociliäre Clearance (MCC)13. Die Methode wäre auch wertvoll für die Bewertung der Wirkung von neuartigen Medikamenten, Gentherapie oder Interventionen auf MCC in diesen Mausmodellen.
Es gibt viele verschiedene Modelle, die verwendet wurden, um MCC zu bewerten. Eine bemerkenswerte Methode beinhaltet die Verwendung von Methylenblaufarbstoff, der in den Bronchus eingeflößt wurde, wobei die Clearance durch Faseroptikmessung der Farbstoffbewegung14gemessen wird. Diese Methode wird durch die Fähigkeit eingeschränkt, die Bewegung des Farbstoffs zu beobachten, was beim Menschen routineistischer ist als bei präklinischen Mausmodellen. Eine weitere bemerkenswerte Methode ist die Synchrotronphasen-Kontrast-Röntgenbildgebung (PCXI), mit der einzelne Partikel in einer Atemwege verfolgt werden können. Diese Methode ist relativ neu und nicht allgemein zugänglich15. Es gibt zahlreiche ex vivo Methoden zur Beurteilung der Atemwege durch Exzisierung einer Luftröhre für die Videomikroskopie, aber diese Modelle bieten wenig Nutzen bei menschlichen Patienten16. Hochauflösende Techniken für Zilien-Bildgebung wie optische Kohärenztomographie sind auf die gleiche Weise begrenzt17.
In diesem Artikel stellen wir eine reproduzierbare Methode zur Messung von MCC in vivo vor, die verwendet wurde, um Lungenabstände in unzähligen Tiermodellen zu messen, sowie MCC bei chronisch obstruktiver Lungenerkrankung zu untersuchen und die Auswirkungen von immunsuppressiven Medikamenten18,19zu bewerten. Diese Methode verfolgt die Clearance des radiopharmazeutischen 99mTechnetium-Schwefelkolloids (99mTc-Sc), eines unlöslichen Partikelradiotracers, nach der Instillation in die Lunge. Das Radionuklid kann dann mit der Computertomographie der einzelnen Photonenemission (SPECT)18,20verfolgt werden. Wir haben diese Technik zur Messung von MCC weiter verfeinert, indem wir die duale Modalität SPECT und Computertomographie (CT) Bildgebung mit Kolokalisierung der Radioisotopenzählungen in der Lunge und Messung der Abnahme dieser Zählungen über 6 Stunden verwendet haben. Dual-Modality-Bildgebung, mit Co-Registrierung von CT- und SPECT-Bildern ermöglicht eine genaue Lokalisierung der Strahlungszählungen in unserer Interessenregion, der Lunge. Obwohl wir die Methode zur MCC-Messung bei Mäusen detailliert beschreiben, kann das Protokoll angepasst werden, um MCC bei Ratten zu untersuchen. Die Kollimatoren müssten ebenso angepasst werden wie die Strahlendosis. Unserer Ansicht nach sind Maus-MCC-Scans aufgrund der kleinen Tiergröße technisch anspruchsvoller, aber aufgrund der großen Anzahl etablierter Mausmodelle einer Reihe menschlicher Störungen nützlicher als Ratten. Darüber hinaus ist aufgrund ihrer geringeren Kosten und Wartungskosten in Tierkolonien eine größere Stichprobengröße bei Mäusen möglich.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>500 &#181;m Unjacketed Fiber Optic Wire</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>02-532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99mTechnecium-Sulfur Colloid</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Vaporizer</td>
			<td>Vetland Medical</td>
			<td>A13480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durmont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>99150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65/1.52p Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Introcan Safety Catheters 20G 1inch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1534477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>118-2097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Intubation Stand</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>ETI-MSE-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siemens Inveon dual-modality SPECT/CT</td>
			<td>Siemens</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Anesthesia Stand</td>
			<td>Summit Anesthesia Solutions</td>
			<td>22860</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo evaluation of mucociliary clearance in mice

Respiratorische motile Zilien, spezialisierte Organellen der Zelle, säumen die apikale Oberfläche der Epithelzellen, die die Atemwege auskleiden. Durch das schlagen in einer metachronalen, synchronen Weise erzeugen diese multiplen, motilen, aktinbasierten Organellen einen Cephalad-Flüssigkeitsfluss, der die Atemwege von eingeatmeten Schadstoffen und Krankheitserregern klärt. Angesichts der zunehmenden Umweltverschmutzung, neuer viraler Krankheitserreger und aufkommenden multiresistenten Bakterien ist die von Zilien erzeugte Schleimhautclearance (MCC) für die Aufrechterhaltung der Lungengesundheit unerlässlich. MCC ist auch bei mehreren angeborenen Erkrankungen wie primäre Ziliardyskinesie, Mukoviszidose sowie erworbene Erkrankungen wie chronisch obstruktive Lungenerkrankungen depressiv. Alle diese Störungen haben, in einigen Fällen mehrere, Mausmodelle etabliert. In dieser Publikation beschreiben wir eine Methode, die eine kleine Menge an Radioaktivität und dual-modaler SPECT/CT-Bildgebung verwendet, um MCC bei Mäusen in vivo genau und reproduzierbar zu messen. Die Methode ermöglicht die Rückgewinnung von Mäusen nach der Bildgebung, die Ermöglichung serieller Messungen und die Längsprüfung potenzieller Therapeutika im Laufe der Zeit. Die Daten bei Wildtypmäusen zeigen die Reproduzierbarkeit der MCC-Messung, solange ausreichend auf Details geachtet wird und das Protokoll strikt eingehalten wird.

Mit diesem Protokoll haben wir Mäuse in einer Isoflurankammer anästhesiert (Abbildung 1A). Nach Erreichen eines ausreichenden Anästhesieniveaus wurden Die Mäuse auf vertikale Stützen gelegt (Abbildung 1B) und die Stimmbänder wurden mit einem beleuchteten Führungsdraht visualisiert (Abbildung 1C-1D). Die Mäuse wurden intubiert und mit 0,2 mCi 99mTc-Sc in Volumen von 10 l durch eine Kanüle eingeweischt und Mäuse durften spontan in die Lunge einatmen (Abbildung 1E-1F). Nach der Bildaufnahme und -verarbeitung wurden die CT- und SPECT-Bilder kolokalisiert (Abbildung 2A) mit dem Phantomrohr als Wahrzeichen (Abbildung 2B). Masken der Lunge wurden aus dem CT-Bild(Abbildung 2C) erzeugt und verwendet, um ROIs um die rechte Lunge für die Analyse bei 0 (Abbildung 2D) und 6 Stunden (Abbildung 2E-2F) zu zeichnen. Um die Reproduzierbarkeit des Protokolls zu testen, wurden insgesamt 8 Mäuse zweimal an verschiedenen Tagen mit identischen Versuchsbedingungen gescannt, wobei die Analyse mit einem gekoppelten t-Test keinen signifikanten Unterschied zwischen den Wiederholungsscans (p-Wert=0,9904) zeigte (Abbildung 3A). Weitere 2 Mäuse wurden dreimal an verschiedenen Tagen mit identischen Versuchsbedingungen gescannt, wobei die Analyse mit einseitiger ANOVA eine signifikante Übereinstimmung zwischen den Wiederholungsscans zeigte (p-Wert 0,0041) (Abbildung 3B). Insgesamt wurden 8 Mäuse gescannt und zwei repräsentative Bilder gezeigt (Abbildung 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig01.jpg"> Abbildung 1: Mausintubierung und Isotopeninstillation. Bilder der Schritte, die zum Intubieren und Einflößen von Isotopen in die Atemwege erforderlich sind. A) Die Maus wird in einer Kammer bezähnstisglich anästhesiert. B) Die anästhesierte Maus wird auf einen vertikalen Träger gelegt, der von den vorderen Schneidezähnen aufgehängt wird. C) Ein beleuchteter 0,5-mm-Glasfaserdraht, der als Führungsdraht dient, wird durch einen 20 G Kanüle vorbereitet. D) Der Mund der Maus wird mit Zangen geöffnet und mit dem beleuchteten Führungsdraht beleuchtet, um die Stimmbänder zu visualisieren. E) Die Kanüle wird über die Stimmbänder geschoben und der Führungsdraht entfernt. F) Lösliches Isotop wird mit einer Pipette in die Kanüle eingeflößt und die Maus darf das Isotop spontan in die Lunge einatmen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig02v2.jpg"> Abbildung 2: SPECT/CT-Bilder eines MCC-Scans. A) Ein SPECT-Bild, das mit einem CT-Bild kolokalisiert wurde. B) Ein CT-Bild mit einem sichtbaren Phantomrohr, das für die Kolokalisierung verwendet wurde. C) Eine Maske der Atemwege, die durch Binarisieren des CT-Bildes und Durchführung einer Z-Stack-Summenprojektion abgeleitet wird. D) Die CT-Maske ist mit dem SPECT-Bild kolokalisiert. Ein ROI für die Analyse wurde um die rechte Lunge gezogen. E) Eine Maske der Atemwege bei 6 Stunden. F) Ein CT und SPECT kolokalisiertes Bild der Atemwege bei 6 Stunden mit einem ROI für die Analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig03.jpg"> Abbildung 3: Clearance-Messungen derselben Mäuse über mehrere Scans hinweg. A) Für 8 Mäuse wurden zwei individuelle Wiederholungsabstände ohne Veränderungen der Versuchsbedingungen gemessen. Ein gekoppelter t-Test zeigte, dass es keinen signifikanten Unterschied zwischen den Wiederholungsscans mit einem p-Wert von 0,9904 gab. B) Für zwei Mäuse wurden drei einzelne Wiederholungsabstände ohne Veränderung der Versuchsbedingungen gemessen. Eine einwegige ANOVA zeigte, dass zwischen den Wiederholungsscans ein signifikanter Übereinstimmung mit einem p-Wert von 0,0041 bestand. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig04.jpg"> Abbildung 4: Kolokalisierte SPECT/CT-Bilder der 0- und 6-stündigen Atemwege bei 2 Mäusen mit ROIs, die bei 0 und 6 Stunden gezeichnet werden und die rechte Lunge umreißen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Abbildung 1: Ein Video der Stimmbänder, die von einem Glasfaserdraht beleuchtet werden, mit dem Effekt der Atmung visualisiert. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929supfig01.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.</a>
Ergänzende Dateien. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/Supplemental_Files.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Dateien herunterzuladen.</a>

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In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice

In dieser Publikation beschreiben wir Protokolle zur Beurteilung der Atemwegs-Mukociliären Clearance (MCC) bei Mäusen in vivo unter Verwendung von Dual-Modality-Radionuklid-Bildgebung. Dieses Protokoll ist für eine einzelne Photonenemissions-Computertomographie (SPECT) und Einerfassungsprotokoll für Computertomographie (CT) mit Maus-Ganzkörper-Kollimatoren (MWB) in einem dualen SPECT/CT-System konzipiert.

In vivo Bewertung der mukociliären Clearance bei Mäusen

Respiratory motile cilia, specialized organelles of the cell, line the apical surface of epithelial cells lining the respiratory tract. By beating in a ...

in-vivo-evaluation-of-mucociliary-clearance-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

4.2K Aufrufe.  University of Pittsburgh School of Medicine. In dieser Publikation beschreiben wir Protokolle zur Beurteilung der Atemwegs-Mukociliären Clearance (MCC) bei Mäusen in vivo unter Verwendung von Dual-Modality-Radionuklid-Bildgebung. Dieses Protokoll ist für eine einzelne Photonenemissions-Computertomographie (SPECT) und Einerfassungsprotokoll für Computertomographie (CT) mit Maus-Ganzkörper-Kollimatoren (MWB) in einem dualen SPECT/CT-System konzipiert.

Serie: In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2 / 3 der Mäuse

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Forschung

Biologie

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

Auswertung der räumlichen Verteilung der γH2AX folgenden ionisierender Strahlung

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the production of new mouse models of disease and investigations into the hormonal regulation of tissue degeneration (or regeneration) following pathological challenge. The murine reproductive (or estrous) cycle is divided into 4 stages: proestrus, estrus, metestrus, and diestrus. Defined fluctuations in circulating levels of the ovarian steroids 17-&beta;-estradiol and progesterone, the gonadotropins luteinizing and follicle stimulating hormones, and the luteotropic hormone prolactin signal transition through these reproductive stages. Changes in cell typology within the murine vaginal canal reflect these underlying endocrine events. Daily assessment of the relative ratio of nucleated epithelial cells, cornified squamous epithelial cells, and leukocytes present in vaginal smears can be used to identify murine estrous stages. The degree of invasiveness, however, employed in collecting these samples can alter reproductive status and elicit an inflammatory response that can confound cytological assessment of smears. Here, we describe a simple, non-invasive protocol that can be used to determine the stage of the estrous cycle of a female mouse without altering her reproductive cycle. We detail how to differentiate between the four stages of the estrous cycle by collection and analysis of predominant cell typology in vaginal smears and we show how these changes can be interpreted with respect to endocrine status.

Here, we describe how to identify the stage of the murine reproductive (proestrus, estrus, metestrus, or diestrus) by simple, non-invasive collection and cytological assessment of vaginal smear samples. We further describe how vaginal cytology reflects circulating hormonal levels underlying transition through the murine reproductive cycle.

Durchführen Vaginal Lavage, Kristallviolettfärbung und Vaginal zytologische Beurteilung für Maus Zyklusstand Staging Identification

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

The forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational tool permitting the experimental assessment of lung function in mice in a comprehensive, detailed, precise and reproducible manner. It provides measurements of respiratory system mechanics through the analysis of pressure and volume signals acquired in reaction to predefined, small amplitude, oscillatory airflow waveforms, which are typically applied at the subject's airway opening. The present protocol details the steps required to adequately execute forced oscillation measurements in mice using a computer-controlled piston ventilator (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada). The description is divided into four parts: preparatory steps, mechanical ventilation, lung function measurements, and data analysis. It also includes details of how to assess airway responsiveness to inhaled methacholine in anesthetized mice, a common application of this technique which also extends to other outcomes and various lung pathologies. Measurements obtained in na&iuml;ve mice as well as from an oxidative-stress driven model of airway damage are presented to illustrate how this tool can contribute to a better characterization and understanding of studied physiological changes or disease models as well as to applications in new research areas.

The present protocol provides a detailed step-by-step description of the procedures required to execute measurements of respiratory system mechanics as well as the assessment of airway responsiveness to inhaled methacholine in mice using the forced oscillation technique (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada).

Auswertung der Atemwege Mechanik in Mäuse mit den Forced Oscillation Technique

The  forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational  tool permitting the experimental assessment of lung function in mice ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Body movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are sheathed by intramuscular connective tissues. Each myofiber contains many myofibrils that run longitudinally along the length of the myofiber. Myofibrils are the contractile apparatus of muscle and they are composed of repeated contractile units known as sarcomeres. A sarcomere unit contains actin and myosin filaments that are spaced by the Z discs and titin protein. Mechanical function of skeletal muscle is defined by the contractile and passive properties of muscle. The contractile properties are used to characterize the amount of force generated during muscle contraction, time of force generation and time of muscle relaxation. Any factor that affects muscle contraction (such as interaction between actin and myosin filaments, homeostasis of calcium, ATP/ADP ratio, etc.) influences the contractile properties. The passive properties refer to the elastic and viscous properties (stiffness and viscosity) of the muscle in the absence of contraction. These properties are determined by the extracellular and the intracellular structural components (such as titin) and connective tissues (mainly collagen) 1-2. The contractile and passive properties are two inseparable aspects of muscle function. For example, elbow flexion is accomplished by contraction of muscles in the anterior compartment of the upper arm and passive stretch of muscles in the posterior compartment of the upper arm. To truly understand muscle function, both contractile and passive properties should be studied.
The contractile and/or passive mechanical properties of muscle are often compromised in muscle diseases. A good example is Duchenne muscular dystrophy (DMD), a severe muscle wasting disease caused by dystrophin deficiency 3. Dystrophin is a cytoskeletal protein that stabilizes the muscle cell membrane (sarcolemma) during muscle contraction 4. In the absence of dystrophin, the sarcolemma is damaged by the shearing force generated during force transmission. This membrane tearing initiates a chain reaction which leads to muscle cell death and loss of contractile machinery. As a consequence, muscle force is reduced and dead myofibers are replaced by fibrotic tissues 5. This later change increases muscle stiffness 6. Accurate measurement of these changes provides important guide to evaluate disease progression and to determine therapeutic efficacy of novel gene/cell/pharmacological interventions. Here, we present two methods to evaluate both contractile and passive mechanical properties of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and the contractile properties of the tibialis anterior (TA) muscle.

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Changes in limb muscle contractile and passive mechanical properties are important biomarkers for muscle diseases. This manuscript describes physiological assays to measure these properties in the murine extensor digitorum longus and tibialis anterior muscles.

Bewertung von Muscle Funktion des Extensor digitorum longus<em&gt; Ex vivo</em&gt; Und Tibialis anterior<em&gt; In situ</em&gt; In Mäuse

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

In vivo siRNA-Transfektion und Gene Knockdown im Rückenmark über Rapid-Nichtinvasive Lendenwirbel intrathekale Injektionen in Mäuse

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

Bewertung der Zebrafisch Nierenfunktion unter Verwendung einer fluoreszierenden Räumungs Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Messung der Steifigkeit von<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Maus Aorten Mit Rasterkraftmikroskopie

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...