يوفر البروتوكول طريقة بسيطة لدراسة الصراصير الأمريكية. آفة صحية شائعة وحشرة مفيدة للطب الصيني التقليدي. وسوف يساعد على استكشاف الآليات الجزيئية لأنشطة الحياة المتعددة للصراصير الأمريكية عن طريق هدم جينات محددة.
الميزة الرئيسية لهذه التكنولوجيا هي أنها يمكن أن تهدم الجينات في الصرصور الأمريكي أو غيرها من الحشرات المماثلة التي ليست مناسبة لتحرير الجينات. يمكن استخدام هذه التكنولوجيا لاستكشاف مجالات مختلفة مثل التنظيم الجيني واللاجيني ، وعملية تطوير الأنسجة ، وتجديد الزوائد ، وسلوك التزاوج ، وغيرها من الجوانب المثيرة للاهتمام للصرصور الأمريكي. هذه التكنولوجيا سهلة التشغيل ومتعددة الاستخدامات.
نقترح الحفاظ على صحة الحيوانات أثناء علاج حقن DSRA. أعتقد أن المبتدئين يمكنهم بسهولة إتقان هذه التقنية بعد عدة جلسات تدريبية. للبدء ، افصل الحوريات الفقس عن oothecae بغربال فتحة أربعة ملليمترات.
اختر P.americana الأبيض المملح حديثا مع أنبوب زجاجي. ضع P.americana في حاويات جديدة وانتظر المرحلة الصحيحة للعلاج. في نظام التفاعل ، أضف 10 ميكرولترات من المخزن المؤقت T7 2X ، و 2 ميكرولتر من T7 Express Enzyme Mix وميكروغرام من منتج PCR.
أخيرا ، قم بتكوين الحجم الإجمالي إلى 20 ميكرولتر بالماء المقطر المزدوج. تخلط بلطف رأسا على عقب يدويا وتحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، ثم 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تمييع 4 ميكروغرام لكل ميكرولتر RNase محلول مع ماء DEPC بنسبة 1 إلى 200.
ثم أضف 1 ميكرولتر من وحدة واحدة لكل ميكرولتر RQ1 RNase Free Dnase و 1 ميكرولتر من محلول RNase المخفف إلى النظام. تحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم أضف 10٪ من الحجم الكلي لخلات الصوديوم وثلاثة أحجام من الحجم الكلي للأيزوبروبانول.
تخلط بلطف رأسا على عقب يدويا ، ثم توضع على الثلج لمدة خمس دقائق وجهاز طرد مركزي على ارتفاع 13،000 غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. إزالة supernatant مع ماصة. بعد ذلك ، اغسل البقايا بنسبة 75٪ من الإيثانول ، مع 25٪ من الماء المعالج DEPC ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 13،000 جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
قم بإزالة supernatant مرة أخرى ، وجفف الكريات في الهواء لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بإذابة الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل بحوالي 100 ميكرولتر من ماء DEPC وتخفيفه إلى التركيز النهائي البالغ 2 ميكروغرام لكل ميكرولتر. قم بإعداد البرنامج في مضخة الحقن المجهري لضمان اتساق حجم كل حقنة.
ثم قم بتنظيف المحقنة عن طريق ملئها بماء DEPC من 8 إلى 10 مرات. قم بتركيب حقنة 10 ميكرولتر على مضخة الحقن الدقيقة. ثم ابدأ تشغيل المضخة واملأ المحقنة ب 10 ميكرولترات من محلول الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل.
تخدير الصراصير بثاني أكسيد الكربون ، ثم التقاطها بلطف باستخدام ملاقط وتسليم الصرصور نحو الإبرة باليد. بعد ذلك ، أدخل الإبرة عبر الفجوة بين اثنين من سوميت البطن أفقيا ضد البشرة. حقن محلول الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل في الصرصور لضمان أن يكون طرف الإبرة أقرب ما يمكن إلى البشرة لتجنب إتلاف الأعضاء الداخلية.
أخيرا ، اسحب طرف الإبرة. ضع الصراصير المحقونة في حاويات الفحص الحيوي النظيفة. انتظر حوالي 10 إلى 20 دقيقة للسماح لهم بالتعافي من آثار ثاني أكسيد الكربون.
قم بتسمية الحاويات بتاريخ الحقن ونوع وجرعة الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل وعمر P.americana. تم اختيار Ddc أو DOPA decarboxylase و Dpp أو decapentaplegic genes كمثالين لمراقبة النمط الظاهري للصراصير المملحة بعد حقن الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل و dsMocK الذي ليس له هدف في الحيوانات تم أخذه كعنصر تحكم سلبي. تم الكشف عن كفاءة RNAi بواسطة qRT PCR.
تم هدم الجينات بشكل كبير مع قيمة P أقل من 0.01 ل dsDdc وأقل من 0.05 ل dsDpp. P.americana مع جينات Ddc الضربة القاضية كان البشرة البيضاء بسبب الميلانين المحظور. في تجربة حقن dsDpp ، عطل RNAi تجديد الأطراف.
يجب أن تكون الحشرات صحية ويتم حقنها دون ضرر. توفر هذه التقنية طريقة بسيطة لاستكشاف وظائف الجينات للحشرات التي لا يمكن تحريرها جينيا مثل الصرصور الأمريكي.
