في هذا البروتوكول ، يمكن استخدام جسمين مضادين من نفس المضيف معا في اختبار التألق المناعي لدراسة تفاعلات الخلية المضيفة ومسببات الأمراض. نظرا لوجود عدد قليل فقط من الأجسام المضادة التجارية المتاحة للتعرف على هياكل الخلايا والبروتينات المحددة في الطفيليات ، يمكن أن يكون هذا البروتوكول مفيدا للغاية. هذا هو بروتوكول التألق المناعي المزدوج سهل التنفيذ الذي يستخدم الأجسام المضادة متعددة النسيلة وأحادية النسيلة التي تربى في نفس النوع.
قد يكون العديد من الباحثين غير مدركين أن هذا ممكن. يساعد هذا النهج عندما يكون مصدر الأجسام المضادة محدودا. يمكن استخدامه للكشف عن مسببات الأمراض في بروتينات الخلية المضيفة في الخلايا المضيفة المصابة ويمكن أيضا تطبيقه على الكائنات الحية الحرة.
هذا بروتوكول بسيط ، يتطلب خطوة حظر واحدة بين الزوج الأول والثاني من الأجسام المضادة. سيتم عرض الإجراء من قبل الدكتورة كاميلا غاشيه كاسترو وطالب الدكتوراه لايس تراجانو سيلفا من مختبري. بعد ثلاثة أيام من إصابة خلايا LLC-MK2 بالمثقبيات الكروزية ، اجمع المادة الفائقة من الخلايا المصابة في أنبوب مخروطي لزراعة الخلايا سعة 15 ملليلتر.
قم بطرد العينة لخفض حطام الخلية ، ثم ضع الأنبوب في درجة حرارة الغرفة للسماح للتريبوماستيجوت بالسباحة إلى السوبرناتانت. بعد 10 دقائق ، اجمع المادة الفائقة في أنبوب مخروطي جديد ، ثم قم بطرد العينة وتخلص من المادة الفائقة قبل إعادة تعليق الكريات التي تحتوي على الطفيليات في وسط RPMI كامل. أضف خلايا LLC-MK2 في 24 لوحة تحتوي على أغطية مستديرة معقمة بالأشعة فوق البنفسجية واسمح ل &m بالاستقرار لمدة 16 ساعة.
ثم لإصابة الخلايا ، أضف مادة فائقة تحتوي على T.Cruzi إلى كل بئر واحتضنها لمدة ست ساعات. بعد ذلك ، اغسل الأغطية التي تحتوي على الخلايا المصابة وغير المصابة خمس مرات باستخدام PBS ، ثم قم بإصلاح الخلايا بنسبة 2٪ paraformaldehyde في PBS. بعد 10 دقائق ، اغسل الأغطية ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها باستخدام PBS ثم تخلل الأغطية بمنظف غير أيوني لمدة 10 دقائق.
بعد ثلاث غسلات PBS لمدة خمس دقائق ، قم باحتضان الأغطية في محلول حجب لمدة 30 دقيقة ، تليها حضانة أخرى لمدة 30 دقيقة إما باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة أو متعدد النسيلة للفأر. بعد غسل PBS ، احتضن الأغطية لمدة 30 دقيقة مع الأجسام المضادة الثانوية في محلول الحجب و phalloidin لتلطيخ خيوط الأكتين في الخلية المضيفة. ثم اغسل الأغطية باستخدام PBS ثلاث مرات مرة أخرى قبل تطبيق كمية صغيرة من كاشف التركيب المضاد للتلاشي مع وسط DAPI على سطح الشريحة.
باستخدام الملقط ، قم بإمالة الغطاء برفق في الوسط لمنع تكوين الفقاعة. لوضع العلامات المزدوجة ، بعد احتضان coverslips في محلول الحجب كما هو موضح سابقا ، احتضنها في الجسم المضاد متعدد النسيلة للفأر لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، اغسل الأغطية ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها باستخدام PBS قبل احتضانها بالجسم المضاد الثانوي لمدة 30 دقيقة.
ثم بعد ثلاث غسلات PBS ، قم بإجراء خطوة حظر ثانية باستخدام AffiniPure rabbit anti-mouse IgG المخفف في محلول الحظر. بعد 30 دقيقة ، اغسل الأغطية باستخدام PBS مرة أخرى قبل احتضانها بالجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر لمدة 30 دقيقة أخرى. بعد ذلك ، بعد ثلاث غسلات PBS ، احتضن الأغطية باستخدام الأجسام المضادة للماعز المضادة للفأر IgG 2B و phalloidin.
ثم بعد ثلاث غسلات PBS ، ضع كاشفا مضادا للتلاشي كما هو موضح سابقا. لوضع العلامات الثلاثية ، بعد حجب coverslips والاحتضان مع الجسم المضاد متعدد النسيلة الفأر ، تليها الأجسام المضادة للماعز المضادة للفأر ، ابدأ حضانة جديدة مع الأجسام المضادة متعددة النسيلة الأرنب في محلول منع لمدة 30 دقيقة. ثم بعد ثلاث غسلات PBS ، احتضن الأغطية بالأجسام المضادة المضادة للأرانب من الماعز لمدة 30 دقيقة.
بعد ذلك ، بعد ثلاث غسلات PBS ، قم بإجراء خطوة حجب باستخدام الجسم المضاد المضاد للفأر AffiniPure Rabbit المخفف في محلول الحجب لمدة 30 دقيقة. ثم اغسل الأغطية مرة أخرى قبل الحضانة بأي جسم مضاد أحادي النسيلة من IgG لمدة 30 دقيقة. بعد ثلاث غسلات PBS ، احتضن الأغطية لمدة 30 دقيقة مع زوج محدد من الأجسام المضادة من فئة الماعز الفرعية IgG المضادة للفأر.
بعد الحضانة ، اغسل الأغطية ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها باستخدام PBS. تحليل عينات الفلورسنت المناعي باستخدام المجهر البؤري مع هدف غمر الزيت 63X والكشف عن التألق باستخدام أنبوب مضاعف ضوئي وكاشف هجين. ثم احصل على جميع الصور البؤرية ذات القنوات المنفصلة وقم بإجراء معالجة الصور باستخدام Adobe Photoshop.
تظهر صور المجهر البؤري هذه نتائج تجارب التحكم للخلايا المصابة وغير المصابة التي تسلط الضوء على خصوصية الأجسام المضادة في الخلية المضيفة والطفيلي الداخلي. تعرف الجسم المضاد متعدد النسيلة للفأر المضاد للتريبانوسوما كروزي FAZ على بروتين T.cruzi العملاق في منطقة تعلق السوط في السوط الطفيلي ، ولكن ليس في الخلية المضيفة. لوحظ توزيع البروتين الريبي النووي النووي غير المتجانس A1 في النوى باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة للفئران التجارية يتعرف فقط على خلايا الثدييات المضيفة ، ولكن ليس الطفيلي.
أيضا ، تم تلطيخ نوى المضيف والطفيليات و kinetoplasts الطفيلي مع DAPI والمضيف F-actin ملطخة مع phalloidin مقترنة ب Alexa 594 ، مما يؤكد خصوصية الأجسام المضادة. يظهر التألق المناعي المزدوج العلامات توزيعات البروتين في المضيف والطفيلي الذي تم تحليله بواسطة المجهر البؤري. وأشار وضع العلامات إلى عدم وجود تفاعل متقاطع بين الأجسام المضادة باستخدام هذه المنهجية.
باختصار ، يقدم البروتوكول الموصوف هنا لدراسة التفاعلات بين المضيف والممرض تقنية أساسية ومفصلة يمكن تكييفها مع أي مزيج من الأجسام المضادة. هذا النهج يجعل التألق المناعي فعالا من حيث التكلفة ويمكن أن يساعد في دراسة توطين اثنين أو أكثر من البروتينات ذات الأهمية عندما يكون هناك عدد قليل من الأجسام المضادة المتاحة.
