En este protocolo, dos anticuerpos del mismo huésped se pueden usar juntos en el ensayo de inmunofluorescencia para estudiar las interacciones entre la célula huésped y el patógeno. Dado que solo hay pocos anticuerpos comerciales disponibles para reconocer estructuras celulares y proteínas específicas en los parásitos, este protocolo puede ser muy útil. Este es un protocolo de inmunofluorescencia de doble etiquetado fácil de realizar que utiliza anticuerpos policlonales y monoclonales criados en la misma especie.
Muchos investigadores pueden no ser conscientes de que esto es posible. Este enfoque ayuda cuando la fuente de anticuerpos es limitada. Se puede utilizar para detectar los patógenos en las proteínas de la célula huésped en las células huésped infectadas y también se puede aplicar a los organismos vivos libres.
Este es un protocolo simple, requiere un paso de bloqueo entre el primer y segundo par de anticuerpos. El procedimiento será demostrado por la Dra. Camila Gachet-Castro y la estudiante de doctorado Lays Trajano-Silva de mi laboratorio. Tres días después de infectar las células LLC-MK2 con Trypanosoma cruzi, recoja el sobrenadante de las células infectadas en un tubo cónico de cultivo celular de 15 mililitros.
Centrifugue la muestra para reducir los desechos celulares, luego coloque el tubo a temperatura ambiente para permitir que los tripomastigotes naden hasta el sobrenadante. Después de 10 minutos, recoja el sobrenadante en un nuevo tubo cónico, luego centrifugue la muestra y deseche el sobrenadante antes de volver a depositar el gránulo que contiene los parásitos en un medio RPMI completo. Agregue células LLC-MK2 en placas de 24 pocillos que contengan cubiertas redondeadas esterilizadas por UV y permita que el &m se asiente durante 16 horas.
Luego, para infectar las células, agregue sobrenadante que contenga T.Cruzi a cada pozo e incube durante seis horas. A continuación, lave las fundas que contienen las células infectadas y no infectadas cinco veces con PBS, luego fije las células con 2% de paraformaldehído en PBS. Después de 10 minutos, lave los cubrehojas tres veces durante cinco minutos cada uno con PBS y luego permeabilice los cubrehojas con detergente no iónico durante 10 minutos.
Después de tres lavados de PBS de cinco minutos, incube los cubrehojas en solución de bloqueo durante 30 minutos, seguido de otra incubación de 30 minutos con un anticuerpo monoclonal o policlonal de ratón. Después de los lavados de PBS, incube los cubrehojas durante 30 minutos con anticuerpos secundarios en solución de bloqueo y faloidina para teñir filamentos de actina en la célula huésped. A continuación, lave las fundas con PBS tres veces más antes de aplicar una pequeña cantidad de reactivo de montaje antidesvanecimiento con medio DAPI a la superficie de la corredera.
Usando fórceps, incline suavemente el lape en el medio para evitar la formación de burbujas. Para el doble etiquetado, después de incubar los coverslips en solución de bloqueo como se demostró anteriormente, incube en el anticuerpo policlonal de ratón durante 30 minutos. A continuación, lave los cubrehojas tres veces durante cinco minutos cada uno con PBS antes de incubarlos con el anticuerpo secundario durante 30 minutos.
Luego, después de tres lavados de PBS, realice un segundo paso de bloqueo con IgG anti-ratón anti-ratón de conejo AffiniPure diluido en solución de bloqueo. Después de 30 minutos, lave las fundas con PBS nuevamente antes de incubarlas con el anticuerpo monoclonal del ratón durante otros 30 minutos. A continuación, después de tres lavados de PBS, incube los cobertores con anticuerpos IgG 2B anti-ratón de cabra y faloidina.
Luego, después de tres lavados de PBS, aplique el reactivo de montaje antidesvanecimiento como se demostró anteriormente. Para el triple etiquetado, después de bloquear los cubrehojas e incubar con el anticuerpo policlonal de ratón, seguido del anticuerpo anti-ratón de cabra, comience una nueva incubación con anticuerpo policlonal de conejo en solución de bloqueo durante 30 minutos. Luego, después de tres lavados de PBS, incube los cubrehojas con anticuerpos anti-conejo de cabra durante 30 minutos.
A continuación, después de tres lavados de PBS, realice un paso de bloqueo con el anticuerpo anti-ratón de conejo AffiniPure diluido en solución de bloqueo durante 30 minutos. Luego lave las fundas nuevamente antes de incubar con cualquier anticuerpo monoclonal IgG de ratón durante 30 minutos. Después de tres lavados de PBS, incube los recubiertos durante 30 minutos con un par específico de anticuerpos de la subclase IgG anti-ratón de cabra.
Después de la incubación, lave los cubrehojas tres veces durante cinco minutos cada uno con PBS. Analizar las muestras inmunofluorescentes utilizando un microscopio confocal con un objetivo de inmersión en aceite 63X y detectar la fluorescencia con un tubo fotomultiplicador y un detector híbrido. A continuación, adquiera todas las imágenes confocales con canales separados y realice el procesamiento de imágenes con Adobe Photoshop.
Estas imágenes de microscopía confocal muestran resultados con los experimentos de control de células infectadas y no infectadas destacando la especificidad de los anticuerpos en la célula huésped y el parásito internalizado. El anticuerpo policlonal de ratón anti-Trypanosoma cruzi FAZ reconoció la proteína gigante T.cruzi en la zona de unión del flagelo en el flagelo del parásito, pero no en la célula huésped. La distribución de la ribonucleoproteína A1 nuclear heterogénea en los núcleos se observó utilizando un anticuerpo monoclonal comercial de ratón que reconoce solo las células de mamíferos huéspedes, pero no el parásito.
Además, los núcleos del huésped y del parásito y los cinetóticos del parásito se tiñeron con DAPI y la F-actina del huésped se tiñó con faloidina conjugada a Alexa 594, lo que confirma la especificidad de los anticuerpos. La inmunofluorescencia de doble marcado muestra las distribuciones de proteínas en el huésped y el parásito analizados por microscopía confocal. El etiquetado no sugirió ninguna reacción cruzada entre anticuerpos utilizando esta metodología.
En resumen, el protocolo aquí descrito para estudiar las interacciones huésped-patógeno presenta una técnica básica y elaborada que puede adaptarse a cualquier combinación de anticuerpos. Este enfoque hace que la inmunofluorescencia sea rentable y puede ayudar a estudiar la localización de dos o más proteínas de interés cuando hay pocos anticuerpos disponibles.
