Neste protocolo, dois anticorpos do mesmo hospedeiro podem ser usados juntos no ensaio de imunofluorescência para estudar interações entre células hospedeiras e patógenos. Como há poucos anticorpos comerciais disponíveis para reconhecer estruturas celulares específicas e proteínas em parasitas, esse protocolo pode ser muito útil. Este é um protocolo de imunofluorescência de dupla rotulagem fácil de executar que usa anticorpos policlonais e monoclonais criados na mesma espécie.
Muitos pesquisadores podem não saber que isso é possível. Essa abordagem ajuda quando a fonte de anticorpos é limitada. Pode ser usado para detectar os patógenos nas proteínas das células hospedeiras em células hospedeiras infectadas e também pode ser aplicado a organismos vivos livres.
Este é um protocolo simples, requerem um passo de bloqueio entre o primeiro e o segundo par de anticorpos. O procedimento será demonstrado pela Dra Camila Gachet-Castro e pela doutoranda Lays Trajano-Silva do meu laboratório. Três dias depois de infectar células LLC-MK2 com Trypanosoma cruzi, colete o supernatante das células infectadas em um tubo cônico de cultura celular de 15 mililitros.
Centrifugar a amostra para diminuir os detritos celulares, em seguida, colocar o tubo em temperatura ambiente para permitir que os tripulações nadam até o sobrenatante. Após 10 minutos, colete o supernasce em um novo tubo cônico, depois centrifuugar a amostra e descartar o supernasal antes de reutilizar a pelota contendo os parasitas em meio RPMI completo. Adicione células LLC-MK2 em placas de 24 poços contendo tampas arredondadas UV e permita que a&m se contente por 16 horas.
Em seguida, para infectar as células, adicione supernasce contendo T.Cruzi a cada poço e incubar por seis horas. Em seguida, lave as tampas contendo as células infectadas e não infectadas cinco vezes com PBS e, em seguida, fixe as células com 2% de paraformaldeído em PBS. Após 10 minutos, lave as tampas três vezes por cinco minutos cada com PBS e, em seguida, permeabilize as tampas com detergente não iônico por 10 minutos.
Após três lavagens pbs de cinco minutos, incubar as tampas na solução de bloqueio por 30 minutos, seguida de outra incubação de 30 minutos com um anticorpo monoclonal ou policlonal do rato. Após as lavagens da PBS, incubar as tampas por 30 minutos com anticorpo secundário na solução de bloqueio e phalloidina para colorição de filamentos actin na célula hospedeira. Em seguida, lave as tampas com PBS três vezes novamente antes de aplicar uma pequena quantidade de reagente de montagem anti-fade com meio DAPI à superfície do slide.
Com fórceps, incline suavemente a mancha de cobertura no meio para evitar a formação de bolhas. Para rotulagem dupla, depois de incubar as tampas na solução de bloqueio, como demonstrado anteriormente, incuba-as no anticorpo policlonal do camundongo por 30 minutos. Em seguida, lave as tampas três vezes por cinco minutos cada com PBS antes de incuba-las com o anticorpo secundário por 30 minutos.
Em seguida, após três lavagens PBS, realize uma segunda etapa de bloqueio com AffiniPure coelho anti-mouse IgG diluído na solução de bloqueio. Após 30 minutos, lave as tampas com PBS novamente antes de incuba-las com o anticorpo monoclonal do rato por mais 30 minutos. Em seguida, depois de três lavagens PBS, incubar as tampas com anticorpo igG 2B anti-rato de cabra e phalloidina.
Em seguida, após três lavagens PBS, aplique reagente de montagem anti-fade como demonstrado anteriormente. Para rotulagem tripla, depois de bloquear as tampas e incubar com o anticorpo policlonal do rato, seguido de anticorpo anti-rato de cabra, inicie uma nova incubação com anticorpo policlonal de coelho na solução de bloqueio por 30 minutos. Em seguida, depois de três lavagens PBS, incubar as tampas com anticorpo anti-coelho de cabra por 30 minutos.
Em seguida, após três lavagens PBS, realize uma etapa de bloqueio com anticorpo anti-rato de coelho AffiniPure diluído em solução de bloqueio por 30 minutos. Em seguida, lave as tampas novamente antes de incubar com qualquer anticorpo monoclonal IgG do mouse por 30 minutos. Após três lavagens PBS, incubar as tampas por 30 minutos com um par específico de anticorpos anti-rato IgG anti-rato de cabra.
Após a incubação, lave as tampas três vezes por cinco minutos cada com PBS. Analise as amostras imunofluorescentes usando um microscópio confocal com um objetivo de imersão de óleo 63X e detecte a fluorescência com um tubo fotomultiplier e detector híbrido. Em seguida, adquira todas as imagens confocal com canais separados e realize o processamento de imagens usando o Adobe Photoshop.
Estas imagens de microscopia confocal mostram resultados com os experimentos de controle de células infectadas e não infectadas destacando a especificidade dos anticorpos na célula hospedeira e do parasita internalizado. O anticorpo policlonal do camundongo anti-Trypanosoma cruzi FAZ reconheceu a proteína gigante T.cruzi na zona de apego flagelolum no flagelo do parasita, mas não na célula hospedeira. A distribuição da ribonucleoproteína nuclear heterogênea A1 nos núcleos foi observada usando um anticorpo monoclonal comercial que reconhece apenas as células mamíferas hospedeiras, mas não o parasita.
Além disso, os núcleos hospedeiros e parasitas e os cinetoplastos parasitas foram manchados com DAPI e o hospedeiro F-actin estava manchado com fhalloidina conjugada à Alexa 594, confirmando a especificidade dos anticorpos. A imunofluorescência de dupla rotulagem mostra as distribuições proteicas no hospedeiro e o parasita analisado pela microscopia confocal. A rotulagem não sugeriu reação cruzada entre anticorpos usando essa metodologia.
Em resumo, o protocolo descrito aqui para estudar interações hospedeiro-patógeno apresenta uma técnica básica e elaborada que pode ser adaptada a qualquer combinação de anticorpos. Essa abordagem torna a imunofluorescência econômica e pode ajudar a estudar a localização de duas ou mais proteínas de interesse quando poucos anticorpos estão disponíveis.
