בפרוטוקול זה, ניתן להשתמש בשני נוגדנים מאותו פונדקאי יחד בבדיקת האימונופלואורסצנטיות כדי לחקור אינטראקציות בין תאים מארחים ופתוגנים. מכיוון שיש רק מעט נוגדנים מסחריים הזמינים לזיהוי מבני תאים וחלבונים ספציפיים בטפילים, פרוטוקול זה יכול להיות שימושי מאוד. זהו פרוטוקול אימונופלואורסצנטי קל לביצוע בעל תיוג כפול המשתמש בנוגדנים פוליקלונליים ומונו-שבטיים הגדלים באותו מין.
חוקרים רבים עשויים להיות מודעים לכך שזה אפשרי. גישה זו מסייעת כאשר מקור הנוגדנים מוגבל. זה יכול לשמש כדי לזהות את הפתוגנים בחלבוני התא המארח בתאים המארחים נגועים והוא יכול להיות מיושם גם על אורגניזמים חיים חופשיים.
זהו פרוטוקול פשוט, דורש צעד חסימה אחד בין זוג הנוגדנים הראשון והשני. ההליך יוצג על ידי ד"ר קמילה גאצ'ט-קסטרו והדוקטורנטית ליס טריאנו-סילבה מהמעבדה שלי. שלושה ימים לאחר הדבקת תאי LLC-MK2 עם טריפנוזומה קרוזי, לאסוף את supernatant מהתאים הנגועים בצינור חרוטי תרבית תא 15 מיליליטר.
צנטריפוגה המדגם כדי להוריד את פסולת התא, ולאחר מכן למקם את הצינור בטמפרטורת החדר כדי לאפשר את trypomastigotes לשחות אל supernatant. לאחר 10 דקות, לאסוף את supernatant בצינור חרוטי חדש, ולאחר מכן צנטריפוגה המדגם להשליך את supernatant לפני resususpending את הכדור המכיל את הטפילים במדיום RPMI מלא. הוסף תאי LLC-MK2 בלוחות של 24 בארות המכילים כיסויים מעוגלים מעוקרים UV ולאפשר ל- the&m להסתפק במשך 16 שעות.
לאחר מכן כדי להדביק את התאים, להוסיף supernatant המכיל T.Cruzi לכל באר ודגרו במשך שש שעות. לאחר מכן, לשטוף את כיסויים המכילים את התאים הנגועים והלא נגועים חמש פעמים עם PBS, ולאחר מכן לתקן את התאים עם 2% paraformaldehyde ב PBS. לאחר 10 דקות, לשטוף את כיסויים שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד עם PBS ולאחר מכן לחלחל את כיסוי עם חומר ניקוי לא יוני במשך 10 דקות.
לאחר שלוש שטיפת PBS של חמש דקות, דגירה של כיסויים בתמיסת חסימה במשך 30 דקות, ואחריה דגירה נוספת של 30 דקות עם נוגדן חד שבטי או פוליקלונלי של עכבר. לאחר שטיפת PBS, לדגור על כיסוי במשך 30 דקות עם נוגדן משני בחסימת פתרון phalloidin כדי להכתים חוטי אקטין בתא המארח. לאחר מכן לשטוף את כיסויים עם PBS שלוש פעמים שוב לפני החלת כמות קטנה של ריאגנט הרכבה אנטי עמעום עם מדיום DAPI על פני השטח של השקופית.
באמצעות מלקחיים, הטה בעדינות את כיסוי הכיסוי במדיום כדי למנוע היווצרות בועות. עבור תיוג כפול, לאחר הדגירה של כיסויים בתמיסת חסימה כפי שהוכח בעבר, לדגור אותם בנוגדן פוליקלונלי העכבר במשך 30 דקות. לאחר מכן, לשטוף את כיסויים שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד עם PBS לפני הדגירה אותם עם הנוגדן המשני במשך 30 דקות.
לאחר מכן בעקבות שלוש שטיפות PBS, לבצע שלב חסימה שני עם ארנב AffiniPure אנטי עכבר IgG מדולל בתמיסת חסימה. לאחר 30 דקות, לשטוף את כיסוי עם PBS שוב לפני הדגירה אותם עם הנוגדן monoclonal העכבר במשך 30 דקות נוספות. לאחר מכן, לאחר שלוש שטיפת PBS, לדגור על כיסוי עם עז אנטי עכבר IgG 2B נוגדן ו phalloidin.
לאחר מכן, לאחר שלוש שטיפות PBS, החל ריאגנט הרכבה נגד עמעום כפי שהוכח בעבר. עבור תיוג משולש, לאחר חסימת כיסוי כיסוי ודגרה עם נוגדן פוליקלונלי העכבר, ואחריו נוגדן נגד עכבר עזים, להתחיל דגירה חדשה עם נוגדן פוליקלונלי ארנב בחסימת פתרון במשך 30 דקות. ואז אחרי שלוש שטיפת PBS, לדגור על כיסוי עם נוגדן נגד ארנב עזים במשך 30 דקות.
לאחר מכן, לאחר שלוש שטיפות PBS, לבצע שלב חסימה עם AffiniPure ארנב נגד עכבר נוגדן מדולל פתרון חסימה במשך 30 דקות. לאחר מכן לשטוף את כיסויים שוב לפני הדגירה עם כל נוגדן IgG חד שבטי עכבר במשך 30 דקות. לאחר שלוש שטיפות PBS, דגירה את כיסוי כיסוי במשך 30 דקות עם זוג ספציפי של עז נגד עכבר IgG נוגדנים מתחת למחלקה.
לאחר הדגירה, לשטוף את כיסוי שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד עם PBS. נתח את דגימות האימונופלואורסצנט באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם מטרת טבילה בשמן פי 63 וזיהה את הפלואורסצנטיות באמצעות שפופרת פוטומולופייר וגלאי היברידי. לאחר מכן רכשו את כל התמונות הקונפוקליות בערוצים מופרדים ובצעו עיבוד תמונה באמצעות Adobe Photoshop.
תמונות מיקרוסקופיות קונפוקליות אלה מראות תוצאות עם ניסויי בקרה של תאים נגועים ולא נגועים המדגישים את הספציפיות של הנוגדנים בתא המארח ואת הטפיל המופנם. הנוגדן הפוליקלונלי נגד טריפנוזומה קרוזי FAZ זיהה את החלבון הענק T.cruzi באזור ההתקשרות עם הפלגלום של הטפיל, אך לא בתא המארח. הפצת ריבונוקלאופרוטאין גרעיני הטרוגניים A1 בגרעינים נצפתה באמצעות נוגדן חד שבטי עכבר מסחרי המזהה רק את תאי היונקים המארחים, אך לא את הטפיל.
כמו כן, גרעין המארח והטפיל והקינטופלסטים הטפילים היו מוכתמים ב- DAPI והמארח F-actin היה מוכתם בפאלאואידין הצמיד לאלקסה 594, המאשר את הספציפיות של הנוגדנים. תיוג כפול של אימונופלואורסצנטיות מראה את התפלגות החלבון בפונדקאי ואת הטפיל המנותח על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. התיוג לא הציע תגובה צולבת בין נוגדנים באמצעות מתודולוגיה זו.
לסיכום, הפרוטוקול המתואר כאן כדי לחקור אינטראקציות מארח-פתוגן מציג טכניקה בסיסית ומורכבת שניתן להתאים לכל שילוב של נוגדנים. גישה זו הופכת את immunofluorescence לחסכוני ויכולה לעזור ללמוד את הלוקליזציה של שני חלבונים או יותר של עניין כאשר מעט נוגדנים זמינים.
