Bu protokolde, aynı konaktan iki antikor, konak hücre ve patojen etkileşimlerini incelemek için immünofluoresans testinde birlikte kullanılabilir. Parazitlerde belirli hücre yapılarını ve proteinleri tanımak için sadece birkaç ticari antikor bulunduğundan, bu protokol çok yararlı olabilir. Bu, aynı türde yetiştirilen poliklonal ve monoklonal antikorları kullanan, gerçekleştirilmesi kolay bir çift etiketleme immünofluoresans protokolüdür.
Birçok araştırmacı bunun mümkün olduğunun farkında olmayabilir. Bu yaklaşım, antikorların kaynağı sınırlı olduğunda yardımcı olur. Enfekte konak hücrelerdeki konak hücre proteinlerindeki patojenleri tespit etmek için kullanılabilir ve serbest canlı organizmalara da uygulanabilir.
Bu basit bir protokoldür, birinci ve ikinci antikor çifti arasında bir engelleme adımı gerektirir. Prosedür laboratuvarımdan Dr. Camila Gachet-Castro ve doktora öğrencisi Lays Trajano-Silva tarafından gösterilecek. LLC-MK2 hücrelerini Trypanosoma cruzi ile enfekte ettikten üç gün sonra, 15 mililitrelik hücre kültürü konik tüpünde enfekte hücrelerden süpernatant toplayın.
Numuneyi hücre kalıntılarını azaltmak için santrifüjlayın, ardından tripomastigotların süpernatanta yüzmesine izin vermek için tüpü oda sıcaklığına yerleştirin. 10 dakika sonra, süpernatantı yeni bir konik tüpte toplayın, ardından örneği santrifüjleyin ve parazitleri içeren peleti tam RPMI ortamında canlandırmadan önce süpernatantı atın. UV sterilize yuvarlak kapaklar içeren 24 kuyulu plakalara LLC-MK2 hücreleri ekleyin ve 16 saat boyunca yerleşmesine izin verin.
Daha sonra hücreleri enfekte etmek için, her kuyuya T.Cruzi içeren süpernatant ekleyin ve altı saat kuluçkaya yatırın. Daha sonra, enfekte ve enfekte olmayan hücreleri içeren kapakları PBS ile beş kez yıkayın, ardından PBS'de% 2 paraformaldehit olan hücreleri sabitlayın. 10 dakika sonra, kapakları pbs ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın ve ardından kapakları iyonik olmayan deterjanla 10 dakika geçirgen hale verin.
Üç beş dakikalık PBS yıkamadan sonra, kapakları 30 dakika boyunca blokaj çözeltisinde kuluçkaya yatırın, ardından fare monoklonal veya poliklonal antikor ile 30 dakikalık bir kuluçka daha yapın. PBS yıkandıktan sonra, kapakları bloke çözeltisinde ikincil antikor ve konak hücredeki akrin filamentlerini lekelendirmek için phalloidin ile 30 dakika kuluçkaya bırakın. Ardından, slaytın yüzeyine DAPI ortamlı az miktarda solmaya karşı montaj reaktifi uygulamadan önce kapakları PBS ile üç kez tekrar yıkayın.
Tokmakları kullanarak, kabarcık oluşumunu önlemek için örtü kapağını hafifçe ortaya eğin. Çift etiketleme için, kapakları daha önce gösterildiği gibi blokaj çözeltisinde inkübe ettikten sonra, fare poliklonal antikorunda 30 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, kapakları 30 dakika boyunca ikincil antikorla kuluçkaya yatırmadan önce PBS ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın.
Ardından üç PBS yıkamayı takiben, engelleme çözeltisinde seyreltilmiş AffiniPure tavşan faresi karşıtı IgG ile ikinci bir engelleme adımı gerçekleştirin. 30 dakika sonra, kapakları fare monoklonal antikoru ile 30 dakika daha kuluçkaya yatırmadan önce PBS ile tekrar yıkayın. Daha sonra, üç PBS yıkandıktan sonra, kapak kapaklarını keçi anti-fare IgG 2B antikor ve phalloidin ile kuluçkaya yatırın.
Ardından üç PBS yıkamayı takiben, daha önce gösterildiği gibi solmaya karşı montaj reaktifi uygulayın. Üçlü etiketleme için, kapakları bloke ettikten ve fare poliklonal antikor ile inkübasyon yaptıktan sonra, ardından keçi anti-fare antikor, 30 dakika boyunca bloke çözeltisinde tavşan poliklonal antikor ile yeni bir inkübasyon başlatın. Daha sonra üç PBS yıkadıktan sonra, kapak kapaklarını keçi anti-tavşan antikor ile 30 dakika kuluçkaya bırakın.
Daha sonra, üç PBS yıkamayı takiben, 30 dakika boyunca blokaj çözeltisinde seyreltilmiş AffiniPure tavşan fare karşıtı antikor ile bir engelleme adımı gerçekleştirin. Daha sonra herhangi bir fare monoklonal IgG alt sınıf antikoru ile kuluçkaya yatırmadan önce kapakları 30 dakika boyunca tekrar yıkayın. Üç PBS yıkamayı takiben, kapak kapaklarını belirli bir çift keçi anti-fare IgG alt sınıf antikoru ile 30 dakika kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, kapakları PBS ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın. 63X yağ daldırma hedefine sahip bir konfokal mikroskop kullanarak immünofluoresan örnekleri analiz edin ve floresan bir fotomultiplier tüp ve hibrit dedektör ile tespit edin. Ardından, ayrılmış kanallara sahip tüm konfokal görüntüleri alın ve Adobe Photoshop kullanarak görüntü işleme gerçekleştirin.
Bu konfokal mikroskopi görüntüleri, konak hücredeki antikorların özgüllüğünü ve içselleştirilmiş paraziti vurgulayan enfekte ve enfekte olmayan hücrelerin kontrol deneyleri ile sonuçları göstermektedir. Fare poliklonal antikor anti-Trypanosoma cruzi FAZ, parazit flagellum'daki flagellum bağlanma bölgesinde T.cruzi dev proteinini tanıdı, ancak konak hücrede tanımadı. Heterojen nükleer ribononiklioprotein A1'in çekirdekteki dağılımı, paraziti değil, sadece konak memeli hücrelerini tanıyan ticari bir fare monoklonal antikoru kullanılarak gözlendi.
Ayrıca, konakçı ve parazit çekirdekleri ve parazit kinetoplastları DAPI ile lekelendi ve konak F-actin, antikorların özgüllüğünü doğrulayan Alexa 594'e konjuge edilen phalloidin ile lekelendi. Çift etiketleme immünofluoresansı konakçıdaki protein dağılımlarını ve konfokal mikroskopi ile analiz edilen paraziti gösterir. Etiketleme, bu metodolojiyi kullanan antikorlar arasında çapraz reaksiyon olmadığını öne sürdü.
Özetle, konak-patojen etkileşimlerini incelemek için burada açıklanan protokol, antikorların herhangi bir kombinasyonuna uyarlanabilen temel ve ayrıntılı bir teknik sunar. Bu yaklaşım immünofiloresansı uygun maliyetli hale getirir ve az sayıda antikor mevcut olduğunda iki veya daha fazla ilgi proteininin lokalizasyonunu incelemeye yardımcı olabilir.
