このプロトコルでは、同じ宿主からの2つの抗体を免疫蛍光アッセイで一緒に使用して宿主細胞および病原体の相互作用を研究することができる。寄生虫の特定の細胞構造やタンパク質を認識するために利用できる市販の抗体はごくわずかであるため、このプロトコルは非常に有用です。これは、同じ種で育てられたポリクローナルおよびモノクローナル抗体を使用する、簡単に実行できる二重標識免疫蛍光プロトコルです。
多くの研究者は、これが可能であることを知らないかもしれません.このアプローチは、抗体の供給源が限られている場合に役立ちます。感染した宿主細胞の宿主細胞タンパク質の病原体を検出するために使用することができ、また、自由な生物に適用することができる。
これは、単純なプロトコルであり、抗体の第1および第2のペア間の1つのブロッキングステップを必要とする。この手順は、私の研究室のカミラ・ガシェ=カストロ博士と博士課程の学生レイズ・トラヤノ・シルバによって実証されます。LLC-MK2細胞をトリパノソーマクルシに感染させた3日後、15ミリリットルの細胞培養円錐管で感染細胞から上清を集める。
サンプルを遠心分離して細胞の破片を下げ、室温にチューブを置き、トリポマスティゴが上清まで泳ぐことを可能にする。10分後、上清を新しい円錐形チューブに集め、次いでサンプルを遠心分離し、完全なRPMI培地に寄生虫を含むペレットを再懸濁する前に上清を捨てる。LLC-MK2細胞をUV殺菌された丸みを帯びたカバーリップを含む24ウェルプレートに追加し、&mが16時間落ち着くことを可能にします。
次に細胞に感染するには、T.Cruziを含む上清を各ウェルに加え、6時間インキュベートする。次に、感染した細胞と非感染細胞を含むカバーリップをPBSで5回洗浄し、次にPBSで2%パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。10分後、PBSでカバーリップを5分間3回洗い、非イオン性洗剤で10分間パーメバリンを透過させます。
3回の5分間のPBSを3回のPBSでのせり付け、ブロッキング溶液中のカバーリップを30分間インキュベートし、続いてマウスモノクローナルまたはポリクローナル抗体で30分間インキュベーションを行います。PBSを溶解した後、ブロッキング溶液中の二次抗体とファロイジンで2次抗体を使用してカバースリップを30分間インキュベートし、宿主細胞内のアクチンフィラメントを染色します。次に、スライドの表面にDAPI培地を用いた少量のアンチフェード実装試薬を塗布する前に、PBSでカバーリップを再び3回洗います。
鉗子を使用して、気泡の形成を防ぐために、媒体のカバースリップを静かに傾けます。二重標識の場合、前述のようにブロッキング溶液中でカバースリップをインキュベートした後、それらをマウスポリクローナル抗体に30分間インキュベートする。次に、PBSでそれぞれ5分間3回カバーリップを洗浄してから、二次抗体で30分間インキュベートします。
次いで3回のPBSを溶解し、ブロッキング溶液で希釈したAffiniPureウサギ抗マウスIgGで第2のブロッキングステップを行う。30分後、PBSでカバーリップを再び洗浄してから、マウスモノクローナル抗体でさらに30分間インキュベートします。次に、3回のPBSをスイーズした後、ヤギの抗マウスIgG2B抗体およびファロイジンでカバースリップをインキュベートする。
次いで、3回のPBSを用いて、前述のようにアンチフェード実装試薬を塗布する。トリプルラベリングの場合、マウスポリクローナル抗体でカバーリップを遮断し、インキュベートした後、ヤギの抗マウス抗体を続け、30分間ブロッキング溶液中でウサギポリクローナル抗体で新しいインキュベーションを開始する。その後、3回のPBSを使用した後、ヤギの抗ウサギ抗体でカバースリップを30分間インキュベートします。
次に、3回のPBSを溶解した後、30分間ブロッキング溶液中で希釈したAffiniPureウサギ抗マウス抗体を用いてブロッキングステップを行う。次に、マウスモノクローナルIgGサブクラス抗体を30分間インキュベートする前に、カバーリップを再び洗浄します。3回のPBSを使用した後、特定のヤギ抗マウスIgGサブクラス抗体で30分間カバーリップをインキュベートします。
インキュベーション後、カバーリップをPBSでそれぞれ5分間3回洗います。63X油浸出目的で共焦点顕微鏡を使用して免疫蛍光サンプルを分析し、光増倍管とハイブリッド検出器で蛍光を検出します。次に、分離されたチャンネルを持つすべての共焦点画像を取得し、Adobe Photoshopを使用して画像処理を実行します。
これらの共焦点顕微鏡画像は、宿主細胞および内在性寄生虫における抗体の特異性を強調する感染細胞および非感染細胞の対照実験を用いた結果を示す。マウスポリクローナル抗体抗体抗トリパノソーマクルシFAZは、寄生虫の旗ラムの付着帯でT.cruzi巨大タンパク質を認識したが、宿主細胞には認識しなかった。核内の異種核リボヌクレオプロテインA1の分布は、宿主哺乳類細胞のみを認識する市販のマウスモノクローナル抗体を用いて観察されたが、寄生虫は認めていない。
また、宿主および寄生虫核及び寄生虫キネトプラストをDAPIで染色し、宿主F-アクチンをアレクサ594に結合させたファロイジンで染色し、抗体の特異性を確認した。二重標識免疫蛍光は、共焦点顕微鏡で分析された宿主および寄生虫におけるタンパク質分布を示す。標識は、この方法論を用いた抗体間の交差反応を示唆しなかった。
要約すると、宿主と病原体の相互作用を研究するためにここで説明するプロトコルは、抗体の任意の組み合わせに適応することができる基本的かつ精巧な技術を提示する。このアプローチは、免疫蛍光を費用対効果の高い、少数の抗体が利用可能な場合に関心のある2つ以上のタンパク質の局在化を研究するのに役立ちます。
