Dans ce protocole, deux anticorps du même hôte peuvent être utilisés ensemble dans le test d’immunofluorescence pour étudier les interactions entre la cellule hôte et l’agent pathogène. Comme il n’y a que peu d’anticorps commerciaux disponibles pour reconnaître des structures cellulaires et des protéines spécifiques chez les parasites, ce protocole peut être très utile. Il s’agit d’un protocole d’immunofluorescence à double marquage facile à réaliser qui utilise des anticorps polyclonaux et monoclonaux élevés chez la même espèce.
De nombreux chercheurs ne savent peut-être pas que c’est possible. Cette approche est utile lorsque la source d’anticorps est limitée. Il peut être utilisé pour détecter les agents pathogènes dans les protéines de la cellule hôte dans les cellules hôtes infectées et peut également être appliqué aux organismes vivants libres.
Il s’agit d’un protocole simple, nécessitant une étape de blocage entre la première et la deuxième paire d’anticorps. La procédure sera démontrée par le Dr Camila Gachet-Castro et la doctorante Lays Trajano-Silva de mon laboratoire. Trois jours après avoir infecté les cellules LLC-MK2 avec Trypanosoma cruzi, prélever le surnageant des cellules infectées dans un tube conique de culture cellulaire de 15 millilitres.
Centrifuger l’échantillon pour abaisser les débris cellulaires, puis placer le tube à température ambiante pour permettre aux trypomastigotes de nager jusqu’au surnageant. Après 10 minutes, prélever le surnageant dans un nouveau tube conique, puis centrifuger l’échantillon et jeter le surnageant avant de remettre en suspension la pastille contenant les parasites dans un milieu RPMI complet. Ajoutez des cellules LLC-MK2 dans des plaques de 24 puits contenant des couvercles arrondis stérilisés aux UV et laissez le &m se déposer pendant 16 heures.
Ensuite, pour infecter les cellules, ajoutez un surnageant contenant du T.Cruzi à chaque puits et incubez pendant six heures. Ensuite, lavez les couvercles contenant les cellules infectées et non infectées cinq fois avec du PBS, puis fixez les cellules avec 2% de paraformaldéhyde dans le PBS. Après 10 minutes, lavez les couvercles trois fois pendant cinq minutes chacun avec du PBS, puis perméabilisez les couvercles avec un détergent non ionique pendant 10 minutes.
Après trois lavages PBS de cinq minutes, incuber les couvercles dans une solution bloquante pendant 30 minutes, suivis d’une autre incubation de 30 minutes avec un anticorps monoclonal ou polyclonal de souris. Après le lavage pbS, incuber les couvercles pendant 30 minutes avec un anticorps secondaire en solution bloquante et de la phalloïdine pour tacher les filaments d’actine dans la cellule hôte. Ensuite, lavez à nouveau les couvercles avec du PBS avant d’appliquer une petite quantité de réactif de montage anti-décoloration avec un milieu DAPI sur la surface de la glissière.
À l’aide de pinces, inclinez doucement le couvercle dans le milieu pour éviter la formation de bulles. Pour le double marquage, après avoir incubé les couvercles dans une solution bloquante comme démontré précédemment, incubez-les dans l’anticorps polyclonal de la souris pendant 30 minutes. Ensuite, lavez les couvercles trois fois pendant cinq minutes chacun avec du PBS avant de les incuber avec l’anticorps secondaire pendant 30 minutes.
Ensuite, après trois lavages PBS, effectuez une deuxième étape de blocage avec AffiniPure lapin anti-souris IgG dilué dans une solution bloquante. Après 30 minutes, lavez à nouveau les couvercles avec du PBS avant de les incuber avec l’anticorps monoclonal de la souris pendant encore 30 minutes. Ensuite, après trois lavages PBS, incuber les couvercles avec des anticorps IgG 2B anti-souris de chèvre et de la phalloïdine.
Ensuite, après trois lavages PBS, appliquez un réactif de montage anti-décoloration comme démontré précédemment. Pour le triple marquage, après avoir bloqué les couvercles et couvé avec l’anticorps polyclonal de souris, suivi d’anticorps anti-souris de chèvre, commencez une nouvelle incubation avec un anticorps polyclonal de lapin en solution bloquante pendant 30 minutes. Ensuite, après trois lavages PBS, incubez les couvercles avec un anticorps anti-lapin de chèvre pendant 30 minutes.
Ensuite, après trois lavages PBS, effectuez une étape de blocage avec l’anticorps anti-souris AffiniPure lapin dilué dans une solution bloquante pendant 30 minutes. Ensuite, lavez à nouveau les couvercles avant d’incuber avec un anticorps monoclonal de la sous-classe IgG de souris pendant 30 minutes. Après trois lavages PBS, incuber les couvercles pendant 30 minutes avec une paire spécifique d’anticorps de sous-classe IgG anti-souris de chèvre.
Après l’incubation, lavez les couvercles trois fois pendant cinq minutes chacun avec du PBS. Analysez les échantillons immunofluorescents à l’aide d’un microscope confocal avec un objectif d’immersion dans l’huile 63X et détectez la fluorescence avec un tube photomultiplicateur et un détecteur hybride. Ensuite, acquérez toutes les images confocales avec des couches séparées et effectuez le traitement d’image à l’aide d’Adobe Photoshop.
Ces images de microscopie confocale montrent des résultats avec les expériences de contrôle de cellules infectées et non infectées mettant en évidence la spécificité des anticorps dans la cellule hôte et le parasite internalisé. L’anticorps polyclonal de souris anti-Trypanosoma cruzi FAZ a reconnu la protéine géante T.cruzi dans la zone d’attachement du flagelle au niveau du flagelle parasite, mais pas dans la cellule hôte. La distribution de la ribonucléoprotéine nucléaire hétérogène A1 dans les noyaux a été observée à l’aide d’un anticorps monoclonal de souris commercial qui ne reconnaît que les cellules de mammifères hôtes, mais pas le parasite.
En outre, les noyaux de l’hôte et du parasite et les kinétoplastes du parasite ont été colorés avec du DAPI et la F-actine de l’hôte a été colorée avec de la phalloïdine conjuguée à Alexa 594, confirmant la spécificité des anticorps. L’immunofluorescence à double marquage montre les distributions de protéines chez l’hôte et le parasite analysées par microscopie confocale. Le marquage n’a suggéré aucune réaction croisée entre les anticorps utilisant cette méthodologie.
En résumé, le protocole décrit ici pour étudier les interactions hôte-pathogène présente une technique de base et élaborée qui peut être adaptée à n’importe quelle combinaison d’anticorps. Cette approche rend l’immunofluorescence rentable et peut aider à étudier la localisation de deux protéines d’intérêt ou plus lorsque peu d’anticorps sont disponibles.
