Exocytosisソフトウェアの自動検出と分析により、pH感受性フルオロフォアのエキソキシティックイベントおよびTIRF画像配列を自動的に検出することができます。また、空間分布や周波数などのエキソサイトーシスの特徴や、半減期やバックグラウンドでの蛍光変化などのエキサイトティックイベントの個々の特性も自動的に出力されます。さらに、エキサイトーティック事象を、文献に記載した4つの様変性モードに分類するオプションが含まれる。
Exocitosis ソフトウェアの自動検出と分析を使用するには、まず [データセットの検索] ボタンをクリックし、データが格納されている場所に移動して、生データと呼ばれるフォルダに入れます。データ ファイルは、ここに自動的に一覧を作成し、このフォルダーに任意の数のデータ ファイルを含めることができます。次に、分析ファイルを格納するディレクトリを選択します。
ここで、testというディレクトリを選びました。また、画像のフレームレートとピクセルサイズも入力します。ここで私のフレームレートはフレームあたり100ミリ秒で、私のピクセルサイズは8ナノメートルです。
最後に、Exocitosis ソフトウェアの自動検出と分析を実行するために、マスク ファイルが必要になります。含まれているマスクメーカーボタンを使用して、データファイルからマスクファイルを自動的に生成することができます。マスクメーカーの走行が終了すると、ランインジケータが黄色に変わり、緑色に戻ります。
マスクは、選択したディレクトリの mask ファイルと呼ばれる新しいフォルダに保存されます。また、マスクファイルは自動的にリストをここに表示します。データ ファイルに対してマスク ファイルが適切に作成されていることを確認し、リスト内の任意のデータ ファイルと対応するマスク ファイルを強調表示することで、これを行うことができます。
データ ファイルの最初のフレームが表示され、選択したマスク ファイルも表示されます。ここは。私たちのマスクファイルは、手元の分析に適していることがわかります。マスクファイルは、ユーザーが別々に提供することもできる。
現在のデータファイルからマスクファイルを作成したい場合は、イメージ J.In を使用してマスクファイルを作成するイメージJで最初に開きます。次に、ポリゴン選択ツールを使用して、セルのエッジをクリックしてマスク ファイルの作成を開始できます。マスクが完成したら、ダブルクリックしてポリゴン全体に接続します。
これが完了したら、編集、選択、マスクの作成に向かいます。反転マスクが作成されます。このマスク ファイルは、データ ファイルと同じ名前で保存し、その後に_mask_fileします。
ここで、独自のカスタム マスク ファイルを提供する場合は、自動検出ソフトウェアにそれらのマスク ファイルの場所を知らせることが重要です。これを行うには、[マスクファイルを検索]ボタンをクリックし、その中にマスクファイルを含むディレクトリに移動します。新しいマスクファイルは、ここにリストを設定します。
分析を実行する前に、すべての単一のデータ ファイルにマスクを設定することが重要です。データセットをロードしたら、マスク ファイル、フレーム レートとピクセル サイズを正しく調整し、選択したディレクトリを選択すると、最終的に分析の一部として分類を含めるかどうかを決定できます。分類ボタンを切り替える場合、exocytic イベントの検出に加えて、各 exocytic イベントは 4 つのクラスのいずれかに分類されます。
分析の実行方法を決定したら、解析ボタンをクリックして分析を開始できます。実行インジケータは、分析が進行中であることを示すために黄色に変わり、分析が終了すると緑色に戻ります。分析が完了すると、実行インジケータが黄色から緑に変わったように、選択したディレクトリ内に新しいデータファイルフォルダが表示されます。
データ ファイル フォルダーには、分析実行で設定された各画像に対応する解析ファイルがあります。また、各画像セットのexocitosの頻度などの要約情報を含むセル統計ファイルがここに記載されています。画像セットごとに、X位置、Y位置、およびエキソキシイベントが発生するフレーム番号に関する情報を含む蛍光トレースファイルがあります。
さらに、各エキサイトーイベントの周囲の関心領域における平均蛍光は、エキサイトーシスの前後の両方に提示される。さらに、X、Y、および時間位置の同様の情報を含むトラッキング ファイルもあります。ただし、分類チェックボックスがオンの場合は、さらに、4 つのクラスのいずれかに属する exocytic イベントの確率を示す 4 つの列が追加されます。
完全な小胞融合瞬間、完全な小胞融合遅延、キスアンドランインスタント、またはキスアンドラン遅延のいずれか。exocytic イベントは、4 つのクラスのうち 1 つに属します (0.5 より大きい場合は、4 つのクラス内で最も高い確率が適用されます)。この場合、最初の exocytic イベントは、4 つのクラスより上の最高の数であり、0.5 より大きいほど、完全な小胞融合瞬時クラスに属します。
さらに、画像セットごとに他にも多数のフィーチャ ファイルがあり、exocytosis の分類時に使用され、さらに分析に関心を持つ可能性があります。最後に、Exocytos の空間的な時間的構成を検出するために Ripley の K 解析を使用する場合は、まずマスク ファイルを neurite マスク ファイルと相馬マスク ファイルに分割します。これを行うには、まず Image J.でマスクを開きます。
このようにして、マスクファイルに記入する時、それは正しい値です。次に、ポリゴン選択ツールを使用して、体細胞領域の輪郭を描きます。今、これは主観的な、手動の意思決定のビットを必要とします。
我々は、粗い楕円体を提案します。完了したら、編集、選択、マスクの作成に進みます。最後に、あなたは私たちの元のマスクファイルに戻って、ソーマを埋めるために編集と記入を使用し、今、我々はあなたが保存する別のノイライトとソーママスクファイルを持っています。
別のニューライトとソーママスクファイルを保存したら、ここでは、マスクファイルが神経突起のためのneurを強調し、ソーマを強調するように、MATLABに来て、neurite 2DネットワークMATLABファイルを開きます。ここでは、現在のフォルダを、すべての分析データを格納したディレクトリに移動します。その後、マスク名パスを新しいマスクファイル(ニューライト)に変更します。
この場合、私はマスクファイルフォルダの下に私の神経ライトマスクファイルを持っています。次に、CSVファイル名を蛍光トレースファイルがある場所に変更します。この場合、データファイルフォルダに残っているので、データファイルはスラッシュされ、蛍光トレースCSVファイルの名前になります。
それが完了したら、実行を打つことができます。これにより、neurite マスク ファイルのスケルトン化されたバージョンが作成され、マスク ファイル フォルダの下に CSV ファイルとして格納されます。次に、ソーマの CSV ファイルも生成します。
これを行うには、CSV マスクの作成者ファイルを開きます。ソーママスクのパスと、作成するCSVファイルの名前を入力します。ここでは、ドットCSVを追加して、同じ正確なファイル名を使用しました。
実行をヒットすると、新しいソーマ CSV ファイルが neurite と一緒に作成されていることがわかります。神経突起マスクとソーママスクの両方のCSVファイルを作成したら、リプリーのK分析を実行できます。これを行うには、R Studio に移動し、リプリーの K 分析 R ファイルを開きます。
ここでは、ニューロンマスクとニューロンデータポイントに注意を払う2つの主要な変数があります。ニューロンマスクは、実行したいマスクファイルを指します。この例では、まずソーママスクファイルを実行しています。
すべてのヌーライト マスク ファイルとは別に、すべての相馬マスク ファイルを実行する必要があります。ここでは、この分析に使用する2つのニューロンがあります。ただし、リプリーの K 分析に必要なだけ使用できますが、このコードをコピーして、ニューロン マスクに貼り付けて、変数を 3 に変更します。
2番目の変数はニューロンデータポイントです。ここでは、すべての抽出された R ファイルによって生成されたファイルをポイントします。今、私のは核融合統計と名付けられたので、それがここで読んでいるものです。
前述のように、私は2番目の相馬マスクファイルとニューロンを持っていますが、これはリプリーのKを一緒に集約できるように一緒に分析されています。これらのパスを正しいパスに変更したら、コードを使用し、領域を実行し、すべてを実行します。実行が完了すると、グループ化されたリプリーの K 値や密度プロットなど、いくつかのプロットが生成されます。
これらは、エクスポートに行く、名前を付けて画像を保存し、適切な画像形式、ディレクトリ、ファイル名、最後に保存を押すことで保存できます。ここでは、TIRF顕微鏡を用いた2日間のインビトロで画像化されたフッ素への通気孔を発現する12個のマウス皮質ニューロンの代表的な結果を見る。Aでは、排泄物の頻度をクラスで割ったことがわかります。
ここでは、完全な小胞融合瞬間が他のクラスよりも頻繁に起こることがわかります。Bでは、モード分布を見ることができ、完全な小胞融合がすべてのイベントの半分以上を占めであることを確認します。Cでは、熱地図としての興奮性の空間分布を決定する。
エキサイトティック事象の大半は、相馬付近のホットスポットや神経突起の遠位端に集まっていることがわかります。Dでは、exocyticイベントが統計的に有意にクラスター化されており、これらのクラスターのサイズは半分から1ミクロンの大きさに及ぶと判断できます。自動化された解析プログラムを使用して、偏りのない方法でexocyticイベントを正しく識別および分析することで、解析効率が向上し、再現性と厳格性が向上します。
検出の精度を確保するためには、撮像時に高いノイズ信号を維持することが重要です。exocytic イベントやその他の pH に敏感な過渡イベントをキャプチャするには、すべてのイベントをキャプチャし、蛍光の半減期やピーク変化などの推定値を改善するのに十分な速さでイメージング周波数が必要です。我々は、このプログラムがニューロンの開発におけるpH感受性蛍光を正確に捕捉するために働くだけでなく、他の細胞タイプも同様に働くことを実証した。
ただし、別のセル型を使用する場合は、他のセル型の一時的なイベントの動作が異なるために、精度の違いを確認することが重要です。この分類は、これまでのニューロンの開発にのみ使用されています。そして、これらのプロセスが他の細胞型またはニューロンの後の発達時のポイントに存在することを知りません。
