O software automatizado de detecção e análise da Exocitosis permitirá que o usuário detecte automaticamente eventos exocíticos e sequências de imagem TIRF de fluoroforos sensíveis ao pH. Também irá produzir automaticamente características de exocitose, como a distribuição espacial ou a frequência, bem como propriedades individuais de eventos exocióticos, como a meia-vida ou a mudança na fluorescência sobre o fundo. Além disso, uma opção está incluída para classificar eventos exocióticos em quatro modos de exocitose, descritos anteriormente na literatura.
Para usar o software de detecção e análise automatizada do software Exocytosis, primeiro você clicará no botão encontrar conjunto de dados e navegará até onde seus dados são depositados e você vai querer colocar em uma pasta chamada dados brutos. Seus arquivos de dados preencherão automaticamente a lista aqui, e você pode ter qualquer número de arquivos de dados nesta pasta. Em seguida, você vai querer escolher um diretório para o qual seus arquivos de análise serão depositados.
Aqui, eu escolhi um diretório chamado teste. Você também vai querer preencher a taxa de quadros de suas imagens, bem como o tamanho do pixel. Aqui minhas taxas de quadro são de cem milissegundos por quadro, meu tamanho de pixel é de oito nanômetros.
Finalmente, você precisará de arquivos de máscara para executar o software de Detecção e Análise Automatizada de Exocistosis. Você pode usar o botão de fabricante de máscaras incluído para gerar automaticamente arquivos de máscara a partir de seus arquivos de dados. O indicador de execução ficará amarelo e depois voltará para o verde quando o fabricante da máscara terminar de funcionar.
Sua máscara será depositada em uma nova pasta chamada arquivos de máscara em seu diretório escolhido. E note, arquivos de máscara preencherão automaticamente a lista aqui. Você vai querer verificar se seus arquivos de máscara são feitos apropriadamente para seus arquivos de dados, e você pode fazer isso destacando qualquer um dos arquivos de dados da lista, bem como o arquivo de máscara correspondente.
O primeiro quadro do seu arquivo de dados aparecerá e o arquivo da máscara selecionado também aparecerá. Aqui. Podemos ver que nossos arquivos de máscara são apropriados para a análise em mãos. Os arquivos da máscara também podem ser fornecidos pelo usuário separadamente.
Quando se deseja fazer um arquivo de máscara a partir de um arquivo de dados atual, recomendamos usar a Imagem J.In ordem para fazê-lo, primeiro abra a imagem na Imagem J da qual você deseja fazer um arquivo de máscara. Em seguida, você pode usar a ferramenta de seleção de polígonos para começar a criar um arquivo de máscara ao redor clicando ao redor da borda da célula. Quando você tiver completado a máscara, clique duas vezes para se conectar a todo o polígono.
Uma vez que isso esteja concluído, você irá editar, seleção e criar máscara. Uma máscara invertida será criada. Você vai querer salvar este arquivo de máscara usando o mesmo nome do arquivo de dados seguido por _mask_file.
Agora, se você fornecer seus próprios arquivos de máscara personalizados, é importante deixar o software de detecção automatizado saber onde esses arquivos de máscara estão localizados. Para isso, você clicará no botão encontrar arquivos de máscara e navegará até o diretório com seus arquivos de máscara. Os novos arquivos de máscaras preencherão a lista aqui.
É importante que você tenha uma máscara para cada arquivo de dados antes que a análise possa ser executada. Agora, uma vez que você tenha seu conjunto de dados carregado, seus arquivos de máscara, sua taxa de quadro e tamanho de pixel ajustado corretamente, e um diretório escolhido, você pode finalmente decidir se você quer incluir classificação como parte de sua análise. Se você alternar o botão de classificação, além de detectar eventos exocióticos, cada evento exocítico será classificado em uma das quatro classes.
Depois de decidir como sua análise será executada, você pode então começar a análise clicando no botão de análise. O indicador de execução se transformará em amarelo para indicar que a análise está em andamento e voltará a ficar verde quando sua análise estiver concluída. Uma vez que a análise esteja concluída, como indicado pelo indicador de execução mudando de amarelo para verde, você notará que uma nova pasta de arquivos de dados apareceu dentro do diretório escolhido.
Dentro da pasta de arquivos de dados, você encontrará arquivos de análise correspondentes a cada imagem definida em sua execução de análise. Além disso, um arquivo de estatísticas de células contendo informações sumárias, como a frequência de exocitese para cada um dos conjuntos de imagens, está aqui. Para cada conjunto de imagens, você tem um arquivo de traços fluorescentes, que contém informações sobre a posição X, posição Y e número do quadro para onde ocorrem eventos exocióticos.
Além disso, a fluorescência média em uma região de interesse em torno de cada evento exocítico é apresentada antes, durante e após a exocitose. Além disso, há também um arquivo de rastreamento, que contém informações semelhantes das posições X, Y e temporal. No entanto, se a caixa de seleção de classificação for verificada, além disso, haverá quatro colunas extras, que indicam a probabilidade do evento exocítico pertencer a uma das quatro classes.
Ou a fusão completa de vesículas instantânea, a fusão completa da vesícula atrasada, o beijo e a execução instantâneos, ou o beijo-e-fuga atrasaram. Um evento exociótico pertence a uma das quatro classes se for maior que 0,5 e for a maior probabilidade dentro das quatro classes regidas. Neste caso, o primeiro evento exocítico aqui pertence à classe instantânea de fusão vesícula completa, pois é o número mais alto acima das quatro classes e é maior que 0,5.
Além disso, há uma série de outros arquivos de recurso para cada conjunto de imagens, que são usados durante a classificação de exocitese e podem ser de interesse para análise suplementar. Finalmente, se quisermos usar a análise K de Ripley para detectar a organização espaço-temporal da exocisose, começaremos dividindo nosso arquivo de máscara em um arquivo de máscara de neurite e um arquivo de máscara soma. Faremos isso primeiro abrindo nossa máscara na Imagem J.Vamos querer usar o seletor de cores para selecionar um pixel de fundo.
E assim, quando preenchemos o arquivo da máscara, é o valor correto. Em seguida, usaremos a ferramenta de seleção de polígonos e delinearemos a região somática. Isso requer um pouco de tomada de decisão manual subjetiva.
sugerimos uma elipse áspera. Depois de completar isso, você irá editar, seleção e criar máscara. Finalmente, você voltará ao nosso arquivo de máscara original e usará editar e preencher para preencher a soma, e agora temos um arquivo separado de máscara de neurite e soma, que você salvará.
Uma vez que você tenha salvo o seu arquivo separado neurite e máscara soma, aqui, eu tenho-o como arquivo de máscara sublinhar neur para neurite e sublinha soma, vamos vir para MATLAB e abrir o arquivo matlab rede neurite 2D. Aqui, navegaremos a pasta atual até nosso diretório onde depositamos todos os nossos dados de análise. Uma vez feito isso, então teremos mudado o caminho do nome da máscara para o nosso novo arquivo de máscara que é o neurite.
Então, neste caso, eu tenho o meu arquivo máscara neurite sob a pasta arquivos de máscara. Em seguida, mudaremos o nome do arquivo CSV para onde nosso arquivo de rastreamento fluorescente está localizado. Neste caso, ele ainda está na pasta de arquivos de dados, e assim os arquivos de dados cortam e o nome do arquivo CSV de traços fluorescentes.
Uma vez que isso tenha sido concluído, você pode então bater run. Isso criará então uma versão esqueletoizada do arquivo da máscara de neurite e depositá-lo como um arquivo CSV sob a pasta de arquivos de máscara, que podemos ver aqui. Em seguida, vamos gerar um arquivo CSV para o soma também.
Para isso, abra o arquivo criador da máscara CSV. Você vai querer colocar no caminho para sua máscara soma e um nome para o arquivo CSV a ser criado. Aqui eu só fui em frente e usei o mesmo nome do arquivo exato, apenas com ponto CSV anexado.
Aperte a execução, e você verá que um novo arquivo soma CSV foi criado ao lado do neurite. Uma vez que tenhamos criado os arquivos CSV para a máscara de neurite e a máscara soma, podemos executar a análise K de Ripley. Para isso, navegaremos até o R Studio e abriremos o arquivo R de análise K da Ripley.
Existem duas variáveis principais aqui para prestar atenção, máscara de neurônio e pontos de dados de neurônios. A máscara de neurônios apontará para qualquer arquivo de máscara que você deseja executar. Neste caso, eu estou primeiro executando os arquivos da máscara soma.
Você vai querer executar todos os seus arquivos de máscara soma separadamente de todos os seus arquivos de máscara de neurite. Aqui, eu tenho dois neurônios, que eu vou usar para esta análise. No entanto, você pode usar quantos quiser para a análise K do Ripley, você só vai querer copiar e colar este código para máscara de neurônio e alterar a variável para três, e em diante.
A segunda variável são os pontos de dados dos neurônios. Aqui você quer apontá-lo para o arquivo que foi gerado por seus recursos todos os arquivos R extraídos. Agora o meu foi nomeado estatísticas de fusão, e é isso que está lendo aqui.
Como mencionado, eu tenho um segundo arquivo de máscara soma e neurônio, que está sendo analisado junto para que possamos agregar o Ripley's K juntos. Depois de mudar esses caminhos para o caminho correto, você usará código, executará região e executará todos. Após a execução ser concluída, várias parcelas serão geradas, incluindo os valores K agrupados de Ripley, bem como as parcelas de densidade.
Estes podem ser salvos indo para exportar, salvar imagem como e escolhendo o formato de imagem apropriado, o diretório, o nome do arquivo e, finalmente, batendo salvar. Aqui vemos resultados representativos de 12 neurônios cortical murinas expressando ventilação para flúor imagem em dois dias in vitro usando microscopia TIRF. Em A, vemos a frequência da exocistose dividida por classe.
Aqui podemos ver que a fusão completa de vesículas instantânea ocorre com mais frequência do que as outras classes. Em B, podemos ver a distribuição do modo, confirmando que a fusão completa de vesículas instantânea compõe mais da metade de todos os eventos. Em C determinamos a distribuição espacial da exocitose como mapa de calor.
Podemos ver que a maioria dos eventos exocióticos estão agrupados em um hotspot perto da soma, bem como nas extremidades distais dos neurites. Em D podemos determinar que os eventos exocióticos são estatisticamente significativamente agrupados, e que o tamanho desses clusters variam de meio míctico a um mícente de tamanho. O uso de um programa de análise automatizado para identificar e analisar corretamente eventos exocíticos de forma imparcial aumenta a eficiência da análise e melhora a reprodutibilidade e o rigor.
Para garantir a precisão da detecção, é importante manter um sinal alto para ruído durante a imagem. Capturar eventos exocióticos ou outros eventos transitórios sensíveis ao pH requer uma frequência de imagem rápida o suficiente para capturar todos os eventos e melhorar estimativas como a meia-vida ou a mudança de pico na fluorescência. Demonstramos que este programa não só funciona para capturar com precisão a fluorescência sensível ao pH no desenvolvimento de neurônios, mas também outros tipos de células.
No entanto, se usar outro tipo de célula, é importante verificar se há diferenças de precisão, devido aos distintos comportamentos de eventos transitórios em outros tipos de células. Esta classificação só tem sido usada no desenvolvimento de neurônios até o momento. E, de fato, não sabemos se esses processos existem em outros tipos de células ou em pontos de tempo de desenvolvimento posteriores em neurônios.
