Программное обеспечение Automated Detection and Analysis Of Exocytosis позволит пользователю автоматически обнаруживать экзоцитарные события и последовательности изображений TIRF чувствительных к pH флуорофоров. Он также будет автоматически выводить особенности экзоцитоза, такие как пространственное распределение или частота, а также отдельные свойства экзоцитарных событий, такие как период полураспада или изменение флуоресценции на фоне. Кроме того, включена опция классификации экзоцитарных событий на четыре способа экзоцитоза, ранее описанные в литературе.
Чтобы использовать программное обеспечение Automated Detection and Analysis of Exocytosis, сначала вы нажмете кнопку «Найти набор данных», перейдете к тому, где депонированы ваши данные, и захотите поместить их в папку под названием «Необработанные данные». Ваши файлы данных будут автоматически заполнять список здесь, и вы можете иметь любое количество файлов данных в этой папке. Затем вы захотите выбрать каталог, для которого будут депонированы ваши файлы анализа.
Здесь я выбрал каталог с именем test. Вы также захотите заполнить частоту кадров ваших изображений, а также размер пикселя. Здесь моя частота кадров составляет сто миллисекунд на кадр, размер моего пикселя составляет восемь нанометров.
Наконец, вам понадобятся файлы масок для запуска программного обеспечения автоматического обнаружения и анализа экзоцитоза. Вы можете использовать включенную кнопку создания масок для автоматического создания файлов масок из файлов данных. Индикатор запуска станет желтым, а затем вернется к зеленому, когда создатель маски закончит работу.
Ваша маска будет депонирована в новую папку под названием файлы маски в выбранном каталоге. И обратите внимание, что файлы масок будут автоматически заполнять список здесь. Вы захотите проверить, что ваши файлы масок правильно сделаны для ваших файлов данных, и вы можете сделать это, выделив любой из файлов данных в списке, а также соответствующий файл маски.
Первый кадр вашего файла данных отобразится, и выбранный файл маски также отобразится. Здесь. Мы видим, что наши файлы масок подходят для анализа. Файлы масок также могут поставляться пользователем отдельно.
Если кто-то хочет сделать файл маски из текущего файла данных, мы рекомендуем использовать Image J.In для этого сначала откройте изображение в Image J, из которого вы хотите сделать файл маски. Затем можно использовать инструмент выделения полигонов, чтобы начать создание файла маски, щелкнув по краю ячейки. Когда маска будет завершена, дважды щелкните ее, чтобы подключиться ко всему полигону.
Как только это будет завершено, вы отправитесь к редактированию, выделению и созданию маски. Будет создана перевернутая маска. Вы захотите сохранить этот файл маски, используя то же имя, что и файл данных, за которым следует _mask_file.
Теперь, если вы предоставляете свои собственные пользовательские файлы масок, важно сообщить программному обеспечению автоматического обнаружения, где находятся эти файлы маски. Для этого вы нажмете кнопку найти файлы масок и перейдете в каталог с файлами масок в нем. Новые файлы маски заполнят список здесь.
Важно, чтобы у вас была маска для каждого отдельного файла данных, прежде чем можно будет запустить анализ. Теперь, после загрузки набора данных, правильной настройки файлов масок, частоты кадров и размера пикселей, а также выбранного каталога, можно окончательно решить, хотите ли вы включить классификацию в свой анализ. Если вы переключите кнопку классификации, помимо обнаружения экзоцитарных событий, каждое экзоцитическое событие будет классифицировано в один из четырех классов.
После того, как вы решили, как будет выполняться анализ, вы можете начать анализ, нажав кнопку анализа. Индикатор пробега станет желтым, чтобы указать, что анализ продолжается, и вернется к зеленому, когда ваш анализ будет завершен. Как только анализ будет завершен, как видно из индикатора запуска, перемещаясь с желтого на зеленый, вы заметите, что в выбранном каталоге появилась новая папка с файлами данных.
В папке файлов данных вы найдете файлы анализа, соответствующие каждому набору изображений в вашем запуске анализа. Кроме того, здесь находится файл статистики клеток, содержащий сводную информацию, такую как частота экзоцитоза для каждого из наборов изображений. Для каждого набора изображений у вас есть файл флуоресцентных трассировок, который содержит информацию о положении X, положении Y и номере кадра для того, где происходят экзоцитарные события.
Кроме того, средняя флуоресценция в интересуемой области вокруг каждого экзоцитарного события представлена как до, так и во время и после экзоцитоза. Кроме того, есть также файл отслеживания, который содержит аналогичную информацию о X, Y и временных положениях. Однако, если флажок классификации установлен, кроме того, будут четыре дополнительных столбца, которые указывают на вероятность экзоцитарного события, относящегося к одному из четырех классов.
Либо полное слияние езикул мгновенно, полное слияние везикул задерживается, поцелуй и бег мгновенно или поцелуй и бег задерживается. Экзоцитическое событие относится к одному из четырех классов, если оно больше 0,5 и является наибольшей вероятностью в четырех управляемых классах. В этом случае первое экзоцитическое событие здесь относится к полному мгновенному слиянию везикул, так как это наибольшее число над четырьмя классами и оно больше 0,5.
Кроме того, существует ряд других файлов функций для каждого набора изображений, которые используются при классификации экзоцитоза и могут представлять интерес для дальнейшего анализа. Наконец, если мы хотим использовать K-анализ Рипли для обнаружения пространственно-временной организации экзоцитоза, мы начнем с разделения нашего файла маски на файл маски нейрита и файл маски сомы. Мы сделаем это, сначала открыв нашу маску в Image J.Мы захотим использовать палитру цветов, чтобы выбрать пиксель фона.
Таким образом, когда мы заполняем файл маски, это правильное значение. Далее мы воспользуемся инструментом выделения полигонов и наметим соматическую область. Теперь это требует немного субъективного, ручного принятия решений.
мы предлагаем грубый эллипсоид. После того, как вы завершите это, вы перейдете к редактированию, выделению и созданию маски. Наконец, вы вернетесь к нашему исходному файлу маски и будете использовать редактирование и заполнение, чтобы заполнить сому, и теперь у нас есть отдельный файл маски нейрита и сомы, который вы затем сохраните.
После того, как вы сохранили свой отдельный файл маски нейрита и сомы, здесь, у меня есть он как файл маски подчеркивания neur для нейрита и подчеркивания soma, мы перейдем к MATLAB и откроем файл сети NEURITE 2D MATLAB. Здесь мы переместимся по текущей папке в наш каталог, где мы депонировали все наши аналитические данные. Как только мы это сделаем, мы изменим путь к имени маски на наш новый файл маски, который является нейритом.
Итак, в этом случае у меня есть файл маски нейрита в папке файлов маски. Затем мы изменим имя CSV-файла на то, где находится наш файл флуоресцентных трассировок. В этом случае он все еще находится в папке файлов данных, и поэтому файлы данных косая черта и имя флуоресцентного traces CSV-файла.
Как только это будет завершено, вы можете нажать «Выполнить». Затем будет создана скелетонизированная версия файла маски нейрита и депонирована как CSV-файл в папку файлов маски, которую мы можем увидеть здесь. Далее мы также сгенерим CSV-файл для soma.
Для этого откройте файл создателя маски CSV. Вы захотите уложить путь к маске soma и имя создаваемого CSV-файла. Здесь я просто пошел дальше и использовал то же самое точное имя файла, только с добавлением точки CSV.
Нажмите «Выполнить», и вы увидите, что вместе с нейритом был создан новый CSV-файл soma. После того, как мы создали CSV-файлы как для маски нейритов, так и для маски сомы, мы можем запустить K-анализ Рипли. Для этого мы перейдем в R Studio и откроем файл R анализа K Ripley.
Здесь есть две основные переменные, на которые следует обратить внимание: маска нейрона и точки данных нейронов. Маска нейрона будет указывать на то, какие файлы маски вы хотите запустить. В этом случае я сначала запускаю файлы масок soma.
Вы захотите запустить все ваши файлы маски soma отдельно от всех ваших файлов маски нейритов. Здесь у меня есть два нейрона, которые я буду использовать для этого анализа. Тем не менее, вы можете использовать столько, сколько захотите для анализа K Рипли, вы просто захотите скопировать и вставить этот код для маски нейрона и изменить переменную на три и далее.
Вторая переменная — это точки данных нейронов. Здесь вы хотите указать ему на файл, который был сгенерирован вашими функциями, все извлеченные R-файлы. Теперь мой был назван статистикой слияния, и это то, что он читает здесь.
Как уже упоминалось, у меня есть второй файл маски сомы и нейрон, который анализируется вместе, чтобы мы могли объединить K Рипли вместе. После изменения этих путей на правильные пути будут использоваться код, область выполнения и запуск всех. После завершения прогона будет сгенерировано несколько графиков, включая сгруппированные значения K Рипли, а также графики плотности.
Их можно сохранить, перейдя к экспорту, сохранению изображения как и выбрав соответствующий формат изображения, каталог, имя файла и, наконец, нажав сохранить. Здесь мы видим репрезентативные результаты от 12 мышиных корковых нейронов, экспрессирующих жерл к фтору, изображенных через два дня in vitro с использованием микроскопии TIRF. В А мы видим частоту экзоцитоза, разделенную по классам.
Здесь мы видим, что полное слияние везикул мгновенно происходит чаще, чем у других классов. В B мы можем видеть распределение мод, подтверждая, что полное мгновенное слияние везикул составляет более половины всех событий. В C мы определяем пространственное распределение экзоцитоза как тепловую карту.
Мы видим, что большинство экзоцитарных событий группируются в горячей точке вблизи сомы, а также на дистальных концах нейритов. В D мы можем определить, что экзоцитарные события статистически значимо сгруппированы, и что размер этих кластеров варьируется от половины микрона до одного микрона в размере. Использование автоматизированной программы анализа для правильного выявления и анализа экзоцитарных событий непредвзятым образом повышает эффективность анализа, повышает воспроизводимость и строгость.
Для обеспечения точности обнаружения важно поддерживать высокий уровень шума во время визуализации. Захват экзоцитарных событий или других pH-чувствительных переходных событий требует частоты визуализации, достаточно быстрой, чтобы захватить все события и улучшить оценки, такие как период полураспада или пиковое изменение флуоресценции. Мы продемонстрировали, что эта программа работает не только для точного захвата pH-чувствительной флуоресценции в развивающихся нейронах, но и в других типах клеток.
Однако при использовании другого типа клеток важно проверить различия в точности из-за различного поведения переходных событий в других типах клеток. Эта классификация использовалась только в разработке нейронов до настоящего времени. И действительно, мы не знаем, существуют ли эти процессы в других типах клеток или в более поздних точках развития нейронов.
