Il software Automated Detection and Analysis Of Exocytosis consentirà all'utente di rilevare automaticamente eventi esocitici e sequenze di immagini TIRF di fluorofori sensibili al pH. Produrrà anche automaticamente caratteristiche di esocitosi come la distribuzione spaziale o la frequenza, nonché proprietà individuali di eventi esocitici, come l'emivita o il cambiamento di fluorescenza sullo sfondo. Inoltre, è inclusa un'opzione per classificare gli eventi esocitici in quattro modalità di esocitosi, precedentemente descritte in letteratura.
Per utilizzare il software di rilevamento e analisi automatizzati dell'esocitosi, per prima cosa farai clic sul pulsante Trova set di dati e navigherai verso dove sono depositati i tuoi dati e ti consigliamo di inserire una cartella chiamata dati grezzi. I tuoi file di dati popoleranno automaticamente l'elenco qui e potrai avere un numero qualsiasi di file di dati in questa cartella. Successivamente, ti consigliamo di scegliere una directory per la quale verranno depositati i tuoi file di analisi.
Qui, ho scelto una directory chiamata test. Ti consigliamo anche di inserire la frequenza dei fotogrammi delle tue immagini e la dimensione dei pixel. Qui i miei frame rate sono di cento millisecondi per fotogramma, la mia dimensione dei pixel è di otto nanometri.
Infine, avrai bisogno di file maschera per eseguire il software di rilevamento e analisi automatizzati dell'esocitosi. È possibile utilizzare il pulsante di creazione di maschere incluso per generare automaticamente file di maschera dai file di dati. L'indicatore di corsa diventerà giallo e poi tornerà in verde quando il produttore di maschere avrà finito di funzionare.
La maschera verrà depositata in una nuova cartella chiamata file maschera nella directory scelta. E nota, i file maschera popoleranno automaticamente l'elenco qui. Ti consigliamo di verificare che i tuoi file di maschera siano fatti in modo appropriato per i tuoi file di dati e puoi farlo evidenziando uno qualsiasi dei file di dati nell'elenco, così come il file di maschera corrispondente.
Verrà visualizzato il primo fotogramma del file di dati e verrà visualizzato anche il file maschera selezionato. Qui. Possiamo vedere che i nostri file di maschera sono appropriati per l'analisi a portata di mano. I file maschera possono anche essere forniti dall'utente separatamente.
Quando si desidera creare un file maschera da un file di dati corrente, si consiglia di utilizzare Image J.In per farlo, aprire prima l'immagine nell'immagine J da cui si desidera creare un file maschera. È quindi possibile utilizzare lo strumento di selezione del poligono per iniziare a creare un file maschera facendo clic attorno al bordo della cella. Una volta completata la maschera, fare doppio clic per connettersi all'intero poligono.
Una volta completato, andrai a modificare, selezionare e creare maschera. Verrà creata una maschera invertita. Si desidera salvare questo file maschera utilizzando lo stesso nome del file di dati seguito da _mask_file.
Ora, se fornisci i tuoi file di maschera personalizzati, è importante far sapere al software di rilevamento automatico dove si trovano quei file di maschera. Per fare ciò, fare clic sul pulsante Trova file maschera e passare alla directory con i file maschera al suo dentro. I nuovi file maschera popoleranno quindi l'elenco qui.
È importante disporre di una maschera per ogni singolo file di dati prima che l'analisi possa essere eseguita. Ora, una volta caricato il set di dati, i file della maschera, la frequenza dei fotogrammi e la dimensione dei pixel regolati correttamente e una directory scelta, è finalmente possibile decidere se si desidera includere la classificazione come parte dell'analisi. Se si attiva il pulsante di classificazione, oltre a rilevare eventi esocitici, ogni evento esocitico verrà classificato in una delle quattro classi.
Una volta deciso il modo in cui eseguire l'analisi, è possibile iniziare l'analisi facendo clic sul pulsante di analisi. L'indicatore di esecuzione diventerà giallo per indicare che l'analisi è in corso e tornerà in verde al termine dell'analisi. Una volta completata l'analisi, come indicato dall'indicatore di esecuzione che cambia da giallo a verde, noterai che una nuova cartella di file di dati è apparsa all'interno della directory scelta.
All'interno della cartella dei file di dati, troverai i file di analisi corrispondenti a ciascun set di immagini nell'esecuzione dell'analisi. Inoltre, un file di statistiche cellulare contenente informazioni di riepilogo come la frequenza di esocitosi per ciascuno dei set di immagini è qui. Per ogni set di immagini, si dispone di un file di tracce fluorescenti, che contiene informazioni sulla posizione X, la posizione Y e il numero di fotogramma per il luogo in cui si verificano eventi esocitici.
Inoltre, la fluorescenza media in una regione di interesse intorno a ciascun evento esocitico viene presentata sia prima, durante e dopo l'esocitosi. Inoltre, c'è anche un file di tracciamento, che contiene informazioni simili delle posizioni X, Y e temporali. Tuttavia, se la casella di controllo di classificazione è selezionata, inoltre, ci saranno quattro colonne aggiuntive, che indicano la probabilità dell'evento esocitico appartenente a una delle quattro classi.
O fusione completa della vescicola istantanea, fusione completa delle vescicole ritardata, bacio e corsa istantanea o bacio e corsa ritardata. Un evento esocitico appartiene a una delle quattro classi se è maggiore di 0,5 ed è la più alta probabilità all'interno delle quattro classi governate. In questo caso, il primo evento esocitico qui appartiene alla classe istantanea di fusione completa delle vescicole, in quanto è il numero più alto sopra le quattro classi ed è maggiore di 0,5.
Inoltre, ci sono una serie di altri file di funzionalità per ogni set di immagini, che vengono utilizzati durante la classificazione dell'esocitosi e possono essere di interesse per ulteriori analisi. Infine, se vogliamo utilizzare l'analisi K di Ripley per rilevare l'organizzazione spazio-temporale dell'esocitosi, inizieremo prima dividendo il nostro file maschera in un file maschera neurite e un file maschera soma. Lo faremo aprendo prima la nostra maschera in Image J.Vorremo usare il selettore di colori per selezionare un pixel di sfondo.
E in questo modo, quando riempiamo il file della maschera, è il valore corretto. Successivamente useremo lo strumento di selezione dei poligoni e delineeremo la regione somatica. Ora questo richiede un po 'di processo decisionale soggettivo e manuale.
suggeriamo un ellissoide ruvido. Una volta completato, andrai a modificare, selezionare e creare maschera. Infine, tornerai al nostro file maschera originale e utilizzerai modifica e compila per riempire il soma, e ora abbiamo un file separato di neurite e maschera soma, che salverai.
Una volta salvato il file separato di neurite e soma mask, qui, l'ho come neur di underscore del file maschera per neurite e underscore soma, verremo su MATLAB e apriremo il file MATLAB di rete 2D di neuriti. Qui, navigheremo nella cartella corrente nella nostra directory dove abbiamo depositato tutti i nostri dati di analisi. Una volta fatto ciò, avremo quindi cambiato il percorso del nome della maschera nel nostro nuovo file maschera che è il neurite.
Quindi, in questo caso, ho il mio file di maschera di neurite nella cartella dei file della maschera. Cambieremo quindi il nome del file CSV in cui si trova il nostro file di tracce fluorescenti. In questo caso, è ancora nella cartella dei file di dati, quindi la barra dei file di dati e il nome del file CSV delle tracce fluorescenti.
Una volta completato, puoi quindi premere run. Questo creerà quindi una versione scheletrata del file della maschera neurite e lo depositerà come file CSV nella cartella dei file maschera, che possiamo vedere qui. Successivamente genereremo anche un file CSV per il soma.
A tale scopo, apri il file csv mask creator. Ti consigliamo di inserire il percorso per la tua maschera soma e un nome per il file CSV da creare. Qui sono andato avanti e ho usato lo stesso nome file esatto, solo con il punto CSV aggiunto.
Premi run e vedrai che un nuovo file CSV soma è stato creato insieme al neurite. Una volta creati i file CSV sia per la maschera di neurite che per la maschera soma, possiamo eseguire l'analisi K di Ripley. Per fare ciò, navigheremo su R Studio e apriremo il file Ripley's K analysis R.
Ci sono due variabili principali a cui prestare attenzione, la maschera neuronale e i punti dati neuronali. La maschera neuronale punterà a qualsiasi file maschera che si desidera eseguire. In questo caso, sto prima eseguendo i file della maschera soma.
Ti consigliamo di eseguire tutti i tuoi file di maschera soma separatamente da tutti i tuoi file di maschera di neurite. Qui, ho due neuroni, che utilizzerò per questa analisi. Tuttavia, puoi usarne quanti ne vuoi per l'analisi K di Ripley, ti consigliamo solo di copiare e incollare questo codice per la maschera neuronale e cambiare la variabile in tre e oltre.
La seconda variabile sono i punti dati neuronali. Qui vuoi indirizzarlo al file che è stato generato dalle tue funzionalità tutto il file R estratto. Ora il mio è stato chiamato fusion stats, e quindi questo è ciò che sta leggendo qui.
Come accennato, ho un secondo file di maschera soma e neurone, che viene analizzato insieme in modo da poter aggregare il K di Ripley insieme. Dopo aver modificato questi percorsi con il percorso corretto, si utilizzerà il codice, l'area di esecuzione e l'esecuzione di tutto. Al termine dell'esecuzione, verranno generati diversi grafici, inclusi i valori K di Ripley raggruppati e i grafici di densità.
Questi possono essere salvati andando a esportare, salvare l'immagine come e scegliendo il formato di immagine appropriato, la directory, il nome del file e infine premendo salva. Qui vediamo i risultati rappresentativi di 12 neuroni corticali murini che esprimono lo sfiato al fluoro ripresi a due giorni in vitro utilizzando la microscopia TIRF. In A, vediamo la frequenza dell'esocitosi divisa per classe.
Qui possiamo vedere che la fusione istantanea completa delle vescicole si verifica più frequentemente rispetto alle altre classi. In B, possiamo vedere la distribuzione del modo, confermando che la fusione completa delle vescicole istantanea costituisce più della metà di tutti gli eventi. In C determiniamo la distribuzione spaziale dell'esocitosi come mappa di calore.
Possiamo vedere che la maggior parte degli eventi esocitici sono raggruppati in un hotspot vicino al soma, così come alle estremità distali dei neuriti. In D possiamo determinare che gli eventi esocitici sono raggruppati statisticamente in modo significativo e che la dimensione di questi cluster varia da mezzo micron a un micron di dimensione. L'uso di un programma di analisi automatizzato per identificare e analizzare correttamente gli eventi esocitici in modo imparziale aumenta l'efficienza dell'analisi e migliora la riproducibilità e il rigore.
Per garantire l'accuratezza del rilevamento, è importante mantenere un segnale elevato al rumore durante l'imaging. L'acquisizione di eventi esocitici o altri eventi transitori sensibili al pH richiede una frequenza di imaging abbastanza veloce da catturare tutti gli eventi e migliorare stime come l'emivita o la variazione di picco della fluorescenza. Abbiamo dimostrato che non solo questo programma funziona per catturare con precisione la fluorescenza sensibile al pH nei neuroni in via di sviluppo, ma anche altri tipi di cellule.
Tuttavia, se si utilizza un altro tipo di cella, è importante verificare le differenze di accuratezza, a causa dei comportamenti distinti di eventi transitori in altri tipi di cellule. Questa classificazione è stata utilizzata solo nello sviluppo di neuroni fino ad oggi. E in effetti non sappiamo che questi processi esistono in altri tipi di cellule o in momenti di sviluppo successivi nei neuroni.
