Tüm monte nöromüsküler kavşakların immünoflüoresan ve morfometrik analizleri için tek iskelet kas liflerinin diseksiyonu. Bu video, EDL ve soleus kaslarını tekrarlanabilir bir yaklaşımla etkili ve güvenli bir şekilde parçalamak için bir protokol gösterecektir. Bu video ayrıca, doğru bir morfometrik analize izin vermek için sinaptik bileşenleri 3D bütünlükle tanımak amacıyla tam monte nöromüsküler kavşakların nasıl elde edeceğini öğretecektir.
Kasları parçalamak için bu cerrahi aletlere ihtiyaç vardır. İşlemi başlatmak için, hayvanı karın yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Ayak uçları arasında arka uzuvlara doğru cerrahi bir bıçak kullanarak ilk kesiyi yapın.
Sağ diz açığa olana kadar yukarı doğru çekerek cildi soyun. EDL'yi bulmak için ayak tendonlarını annular ligamente kadar takip edin. Bu bağ iki tendonu çevreler.
İki tendon arasındaki Uniband makası ile bağı kesin. Her ikisini de kaldırarak ve hangisinin tosların yukarı doğru hareket ettiğini görerek EDL tendonu tanımlayın. Tendonu makasla kesin.
Tendonu biyolojik cımbızla tutarken, EDL kasını diğer arka uzuv kaslarından yavaşça ayırmaya başlayın. Kasın hasara yol açmadan ayrılması, EDL tendonunun bölünen bölümünden kası tutup kaldırırken, aralarında bir yol açmak için yanal kasların geri kalanında çeşitli kesikler yapılarak yapılabilir. Kası tamamen izole etmek için, Uniband makası kullanarak sıçan dizine takılan tendonu kesin.
Parçalanmış kası fiksatif çözeltiye daldırın ve dört santigrat derecede 24 saat bekletin. Genel olarak, uzun bir kas olması yararlıdır. Bunu yapmak için, sabitleme için kası takmak için karton ve zımba kullanın.
Soleus kasını izole etmek için hayvanı çevirin. Deriden, cerrahi bir bıçak kullanarak kalkal tendonu kesin. Biyolojik cımbız ve Uniband makas yardımıyla gastrocnemius kasını kemiklerden ayırarak kas kapağı oluşturur.
Soleus kas kapağının iç tarafında olacaktır. Kırmızı ve düz olduğu için tanımlanabilir. Bir çift biyolojik cımbızla, yukarıdaki gastrocnemius'un üzerinde bulunan soleus tendona ulaşın ve kaldırın.
Uniband makasıyla tendonu kesin. Zayıf bağlanma noktalarının bir kısmını keserken tüm kası kaldırın. Son olarak, soleus kasını tamamen serbest etmek için, kalkaneal tendonu oluşturan soleus vesicle'ı kesin.
EDL kası ile yapılan sabitleme adımını tekrarlayın. Bu yöntemi kullanmak için, zımbaları kaslara değil tendonlara sabitlemek önemlidir. 24 saatlik fiksasyon süresi geçtikten sonra, kas liflerini izole etmeye başlamadan önce kasları DPBS çözeltisinde durulayın.
Lifleri izole etmek için, tendonlardan birini bir çift biyolojik cımbızla hafifçe tutun. Daha sonra diğer biyolojik cımbız çifti ile, kas liflerini ayırmak için tendonu yavaşça sıkıştırmaya başlar. Lifleri izole etmek için yavaşça karşı kas tendonuna doğru yukarı doğru çekin.
Birden fazla, küçük, yalıtılmış demet elde edene kadar bu eylemi birkaç kez tekrarlamak gerekecektir. Küçük izole demetler halinde ayrıldıktan sonra, önceden işlenmiş silanize bir kaydıraktan dikkatlice yerleştirin. Tüm lifleri üst üste binmeyecek şekilde düzenli tutmak gerekir.
Bu noktada lifler 24 saat boyunca hava kurutulur. 24 saat sonra, immünostainasyona başlayın. Su geçirmez bir bariyer oluşturmak için, önceden tedavi edilmiş slayttaki izole kas liflerini çevrelemek için bir PAP kalemi kullanın.
Bu, burada açıklanan protokolün ardından elde edilebilen yüksek çözünürlüklü bir konfokal görüntü örneğidir. Sol üstte, post-sinaptik öğe gösterilir ve sağ üstte, sinaptik öncesi öğe gösterilirken, alt görüntüler morfometrik analiz için kullanılacak parametreleri göstermek için şematize edilmiş sinaptik bileşenleri gösterir. İkinci slayt, sinaptik öncesi ve sonrası sinyallerin API'nin çekirdek lekesiyle birleştirilmesini gösterir.
Transgenik hayvanların ve transgenik olmayan hayvanların nöromüsküler kavşakları arasındaki farklılıklar açıkça görülebilir. Nöromüsküler kavşakların morfometrik analizi, transgenik hayvanlarda sinaptik sonrası sinyalin kanıtlarını gösterir ve esas olarak nöromüsküler kavşak toplam alanının azalması nedeniyle daha kompakt görünmektedir. Burada gösterildiği gibi, transgenik hayvanın nöromüsküler kavşak pre-sinaptik alanı azalır.
Tespit edilen en küçük, örneğin B görüntüsünde gösterildiği gibi fosforilasyon önleyici nörofilament sinyali ile bulunandı. Son görüntü, tam monte nöromüsküler kavşakların durumuyla ilgili sonuçları göstermektedir. Kapsama indeksi kullanılarak transgenik nöromüsküler kavşakların kısmen denervatlı olduğu tespit edilmiştir.
Ayrıca, fosforilasyonlu nörofilamentin kapsamının ve nexus'unun fosforilasyonlu olmayan bir nörofilament tespit edildiğinde elde edilenden daha düşük olduğunu belirleyebilir. Önerilen protokol, yavaş ve hızlı kas liflerinden yüksek kaliteli nöromüsküler kavşak preparatları elde etmeyi sağlar. Sinaptik öncesi ve sonrası nöromüsküler kavşak bileşenleri belirli problar veya antikorlar tarafından tanımlandı ve daha sonra konfokal veya süper çözünürlüklü konfokal mikroskopi ile görüntülenerek mikrometrik ölçekte morfometrik analize olanak sağladı.
