Dissection des fibres musculaires squelettiques simples pour des analyses immunofluorescentes et morphométriques des jonctions neuromusculaires de entier-montage. Cette vidéo démontrera un protocole pour disséquer efficacement et sûrement les muscles EDL et soleus avec une approche reproductible. Cette vidéo enseignera également comment obtenir des jonctions neuromusculaires à montage entier dans le but de reconnaître les composants synaptiques avec intégrité 3D pour permettre une analyse morphométrique précise.
Pour disséquer les muscles, ces instruments chirurgicaux sont nécessaires. Pour commencer la procédure, placez l’animal avec l’abdomen tourné vers le haut. Faites une incision initiale à l’aide d’une lame chirurgicale entre les orteils vers les membres postérieurs.
Décollez la peau, en tirant vers le haut jusqu’à ce que le genou droit soit exposé. Pour trouver le CARE, suivez les tendons du pied jusqu’au ligament annulaire. Ce ligament entoure deux tendons.
Coupez le ligament avec les ciseaux Uniband entre les deux tendons. Identifiez le tendon EDL en soulevant les deux et en voyant lequel fait bouger les toteils vers le haut. Couper le tendon avec des ciseaux.
Tout en tenant le tendon avec une pince à épiler biologique, commencez à séparer lentement le muscle EDL des autres muscles des membres postérieurs. La séparation du muscle sans causer de dommages peut être faite en faisant diverses coupes sur le reste des muscles latéraux pour ouvrir un chemin entre eux, tout en maintenant et en soulevant le muscle de la section de division du tendon EDL. Pour isoler complètement le muscle, coupez le tendon attaché au genou du rat à l’aide de ciseaux Uniband.
Plongez le muscle disséqué dans la solution fixatrice et laissez-le pendant 24 heures à quatre degrés Celsius. En général, il est utile d’avoir un muscle allongé. Pour ce faire, utilisez du carton et des agrafes pour fixer le muscle pour la fixation.
Pour isoler le muscle soleus, retournez l’animal. À travers la peau, coupez le tendon calcanéal à l’aide d’une lame chirurgicale. Avec l’aide de la pince à épiler biologique et des ciseaux Uniband, séparez le muscle gastrocnémien des os, créant ainsi un couvercle musculaire.
Le soleus sera sur le côté interne du couvercle musculaire. Il peut être identifié parce qu’il est rouge et plat. Avec une paire de pinces biologiques, atteignez et soulevez le tendon du soleus qui se trouve au-dessus du gastrocnémien.
Coupez le tendon avec des ciseaux Uniband. Soulevez tout le muscle tout en coupant certains des points d’attache faibles. Enfin, pour libérer complètement le muscle soleus, coupez la vésicule du soleus qui forme le tendon calcanéal.
Répétez l’étape de fixation comme cela a été fait avec le muscle EDL. Pour utiliser cette méthode, il est important de fixer les agrafes aux tendons et non au muscle. Une fois la période de fixation de 24 heures écoulée, rincez les muscles dans une solution de DPBS avant de commencer à isoler les fibres musculaires.
Afin d’isoler les fibres, tenez doucement l’un des tendons avec une paire de pinces biologiques. Ensuite, avec l’autre paire de pinces biologiques, commencez à pincer lentement le tendon pour séparer les fibres musculaires. Pour isoler les fibres, tirez lentement vers le haut vers le tendon musculaire opposé.
Il sera nécessaire de répéter cette action plusieurs fois jusqu’à obtenir plusieurs petits faisceaux isolés. Une fois séparés en petits faisceaux isolés, placez-les soigneusement dans une lame silanisée prétrâturée. Il est nécessaire de garder toutes les fibres ordonnées afin qu’elles ne se chevauchent pas.
À ce stade, les fibres peuvent être laissées à sécher à l’air pendant 24 heures. Après 24 heures, commencez l’immunomarquage. Pour créer une barrière étanche, utilisez un stylo PAP pour encercler les fibres musculaires isolées dans la lame prétraitée.
C’est un exemple d’une image confocale haute résolution qui peut être obtenue suivant le protocole décrit ici. En haut à gauche, l’élément post-synaptique est représenté, et en haut à droite, l’élément pré-synaptique, tandis que les images du bas montrent les composants synaptiques schématisés afin d’illustrer les paramètres qui seront utilisés pour l’analyse morphométrique. La deuxième diapositive montre la fusion des signaux pré-et post-synaptiques avec la tache des noyaux de l’API.
Les différences entre les jonctions neuromusculaires des animaux transgéniques et des animaux non transgéniques sont clairement visibles. L’analyse morphométrique des jonctions neuromusculaires montre l’évidence du signal poteau-synaptique chez les animaux transgéniques et semble être plus compacte, principalement en raison de la zone totale réduite de jonction neuromusculaire. Comme indiqué ici, la zone pré-synaptique de jonction neuromusculaire de l’animal transgénique est réduite.
Le plus petit détecté était celui trouvé avec le signal de neurofilament anti-phosphorylé, comme le montre l’image B, par exemple. La dernière image montre les résultats relatifs à l’état des jonctions neuromusculaires de montage entier. Utilisant l’index de couverture, on l’a établi que les jonctions neuromusculaires transgéniques se sont avérées être partiellement énervées.
En outre, il pourrait déterminer que la couverture et le lien du neurofilament phosphorylé sont inférieurs à ceux obtenus lorsqu’un neurofilament non phosphorylé est détecté. Le protocole proposé permet d’obtenir des préparations de jonction neuromusculaire de haute qualité à partir de fibres musculaires lentes et rapides. Des composants neuromusculaires pré-et poteau-synaptiques de jonction ont été identifiés par des sondes ou des anticorps spécifiques, et puis es imaged dans la microscopie confocale confocale ou de super-résolution, permettant l’analyse morphométrique à une échelle micrométrique.
