Dissezione di singole fibre muscolari scheletriche per analisi immunofluorescenti e morfometriche di giunzioni neuromuscolari a montaggio intero. Questo video dimostrerà un protocollo per sezionare in modo efficace e sicuro i muscoli EDL e soleus con un approccio ripetibile. Questo video insegnerà anche come ottenere giunzioni neuromuscolari a montaggio intero con l'obiettivo di riconoscere componenti sinaptici con integrità 3D per consentire un'accurata analisi morfometrica.
Per sezionare i muscoli, sono necessari questi strumenti chirurgici. Per iniziare la procedura, posizionare l'animale con l'addome rivolto verso l'alto. Effettuare un'incisione iniziale utilizzando una lama chirurgica tra le dita dei piedi verso gli arti posteriori.
Staccare la pelle, tirando verso l'alto fino a quando il ginocchio destro non è esposto. Per trovare l'EDL, seguire i tendini del piede fino al legamento anulare. Questo legamento circonda due tendini.
Tagliare il legamento con le forbici Uniband tra i due tendini. Identificare il tendine EDL sollevando entrambi e vedendo quale fa muovere le dita dei piedi verso l'alto. Tagliare il tendine con le forbici.
Tenendo il tendine con pinzette biologiche, inizia a separare lentamente il muscolo EDL dagli altri muscoli degli arti posteriori. La separazione del muscolo senza causare danni può essere fatta facendo vari tagli sul resto dei muscoli laterale per aprire un percorso tra di loro, tenendo e sollevando il muscolo dalla sezione di scissione del tendine EDL. Per isolare completamente il muscolo, tagliare il tendine attaccato al ginocchio del topo usando le forbici Uniband.
Immergere il muscolo sezionato nella soluzione fissante e lasciarlo per 24 ore a quattro gradi Celsius. In generale, è utile avere un muscolo allungato. Per fare questo, utilizzare cartone e graffette per attaccare il muscolo per la fissazione.
Per isolare il muscolo soleo, capovolgere l'animale. Attraverso la pelle, tagliare il tendine calcaneale usando una lama chirurgica. Con l'aiuto delle pinzette biologiche e delle forbici Uniband, separare il muscolo gastrocnemio dalle ossa, creando un coperchio muscolare.
Il soleo sarà sul lato interno del coperchio muscolare. Può essere identificato perché è rosso e piatto. Con un paio di pinzette biologiche, raggiungere e sollevare il tendine soleo che si trova sopra il gastrocnemio sopra.
Tagliare il tendine con le forbici Uniband. Sollevare l'intero muscolo mentre si tagliano alcuni dei punti di attacco deboli. Infine, per liberare completamente il muscolo soleo, tagliare la vescicola del soleo che forma il tendine calcaneale.
Ripetere la fase di fissazione come fatto con il muscolo EDL. Per utilizzare questo metodo, è importante fissare le graffette ai tendini e non al muscolo. Una volta superato il periodo di fissazione di 24 ore, sciacquare i muscoli nella soluzione DPBS prima di iniziare a isolare le fibre muscolari.
Per isolare le fibre, tenere delicatamente uno dei tendini con un paio di pinzette biologiche. Quindi, con l'altra coppia di pinzette biologiche, inizia a pizzicare lentamente il tendine per separare le fibre muscolari. Per isolare le fibre, tirare lentamente verso l'alto verso il tendine muscolare opposto.
Sarà necessario ripetere questa azione più volte fino a ottenere più, piccoli bundle isolati. Una volta separati in piccoli fasci isolati, posizionarli con cura in uno scivolo silanizzato pretrattato. È necessario mantenere tutte le fibre in ordine in modo che non si sovrappongano.
A questo punto, le fibre possono essere lasciate asciugare all'aria per 24 ore. Dopo 24 ore, inizia l'immunosocienza. Per creare una barriera impermeabile, utilizzare una penna PAP per circondare le fibre muscolari isolate nello scivolo pretrattato.
Questo è un esempio di un'immagine confocale ad alta risoluzione che può essere ottenuta seguendo il protocollo descritto qui. In alto a sinistra, viene mostrato l'elemento post-sinaptico, e in alto a destra, l'elemento presinaptico, mentre le immagini in basso mostrano i componenti sinaptici schematizzati al fine di illustrare i parametri che verranno utilizzati per l'analisi morfometrica. La seconda diapositiva mostra l'unione dei segnali pre e post-sinaptici con la macchia dei nuclei dell'API.
Le differenze tra le giunzioni neuromuscolari di animali transgenici e animali non transgenici sono chiaramente visibili. L'analisi morfometrica delle giunzioni neuromuscolari mostra prove del segnale post-sinaptico negli animali transgenici e sembra essere più compatta, principalmente a causa della ridotta area totale della giunzione neuromuscolare. Come mostrato qui, l'area pre-sinaptica della giunzione neuromuscolare dell'animale transgenico è ridotta.
Il più piccolo rilevato è stato quello trovato con segnale di neurofilamento anti-fosforilato, come mostrato nell'immagine B, per esempio. L'ultima immagine mostra i risultati relativi allo stato delle giunzioni neuromuscolari a montaggio intero. Utilizzando l'indice di copertura, è stato stabilito che le giunzioni neuromuscolari transgeniche sono state trovate parzialmente denervate.
Inoltre, potrebbe determinare che la copertura e il nesso del neurofilamento fosforilato è inferiore a quello ottenuto quando viene rilevato un neurofilamento non fosforilato. Il protocollo proposto consente di ottenere preparati di giunzione neuromuscolare di alta qualità da fibre muscolari lente e veloci. I componenti di giunzione neuromuscolare pre e post-sinaptica sono stati identificati da sonde o anticorpi specifici, e quindi immagini in microscopia confocale o confocale a super-risoluzione, consentendo l'analisi morfometrica su scala micrometrica.
