全マウント神経筋接合部の免疫蛍光および形態測定解析のための単一骨格筋線維の解剖このビデオでは、反復可能なアプローチでEDLとソレウスの筋肉を効果的かつ安全に解剖するためのプロトコルを示します。このビデオでは、正確な形態測定分析を可能にするために、3D完全性を持つシナプス成分を認識することを目的として、全マウント神経筋接合部を取得する方法も説明します。
筋肉を解剖するために、これらの外科器具が必要である。手順を開始するには、腹部を上向きにして動物を置きます。後肢に向かってつま先の間の外科用ブレードを使用して最初の切開を行います。
皮膚を剥がし、右膝が露出するまで上に引っ張ります。EDLを見つけるには、足腱を環状靭帯に従ってください。この靭帯は2つの腱を囲む。
2つの腱の間のユニバンドはさみで靭帯を切ります。両方を持ち上げ、つま先を上向きに動かすものを見て、EDL腱を識別します。はさみで腱を切ります。
生物学的ピンセットで腱を保持しながら, ゆっくりと他の後肢の筋肉からEDL筋肉を分離し始めます.損傷を引き起こさずに筋肉の分離は、EDL腱の分割部から筋肉を保持し、持ち上げながら、それらの間のパスを開くために横筋の残りの部分に様々なカットを行うことによって行うことができます。筋肉を完全に分離するには、ユニバンドハサミを使用してラット膝に取り付けられた腱を切断します。
解剖した筋肉を固定液に浸し、摂氏4度で24時間放置します。一般に、細長い筋肉を持つことは有用である。これを行うには、固定のために筋肉を取り付けるために段ボールとステープルを使用してください。
ソレウスの筋肉を分離するには、動物をひっくり返します。皮膚を通して、外科用ブレードを使用して踵腱を切断する。生物学的ピンセットとユニバンドはさみの助けを借りて、胃腸筋を骨から分離し、筋肉の蓋を作り出す。
ソレウスは筋肉の蓋の内側側になります。赤と平坦なので識別できます。生物学的ピンセットのペアで、手を伸ばし、胃腸の上にあるソレウス腱を持ち上げます。
ユニバンドはさみで腱を切ります。弱いアタッチメントポイントの一部を切断しながら、筋肉全体を持ち上げます。最後に、ソレウスの筋肉を完全に解放するために、踵腱を形成するソレウス小胞を切断する。
EDL筋肉で行われたように固定手順を繰り返します。この方法を使用するには、腱のステープルを筋肉に固定せず、重要です。固定の24時間の期間が経過したら, 筋線維を分離し始める前に、DPBS溶液中の筋肉をすすいでください..
繊維を分離するために、1組の生物学的ピンセットで腱をそっと保持する。次に、生物学的ピンセットの他のペアで、ゆっくりと筋線維を分離するために腱をつまみ始める。繊維を分離するには、ゆっくりと反対側の筋肉腱に向かって上向きに引っ張ります。
複数の小さな分離バンドルを取得するまで、この操作を数回繰り返す必要があります。小さな分離されたバンドルに分離したら、前処理されたシラナイズスライドに慎重に配置します。繊維が重ならないように、すべての繊維を整然と保つ必要があります。
この時点で、繊維は24時間空気乾燥したままにすることができる。24時間後、免疫染色を開始する。防水バリアを作成するには、PAPペンを使用して、前処理されたスライドで孤立した筋線維を囲みます。
これは、ここで説明するプロトコルに従って得ることができる高解像度共焦点像の一例である。左上にはシナプス後要素が表示され、右上にはシナプス前要素が表示され、下の画像は形態解析に使用されるパラメータを示すためにスキーマ化されたシナプス成分を示しています。2 番目のスライドでは、API の核染色とシナプス前およびシナプス後のシグナルのマージを示しています。
トランスジェニック動物と非トランスジェニック動物の神経筋接合部の違いは明らかに見える。神経筋接合の形態学的分析は、トランスジェニック動物におけるシナプス後シグナルの証拠を示し、主に神経筋接合接合の総面積の減少により、よりコンパクトであるように見える。ここに示すように、トランスジェニック動物の神経筋接合前シナプス領域が減少する。
検出された最小のものは、例えば画像Bに示すように、抗リン酸化ニューロフィラメント信号で見つかったものである。最後の画像は、全マウント神経筋接合部の状態に関する結果を示しています。カバレッジ指標を用いて、トランスジェニック神経筋接合部が部分的に脱熱されることを発見することが確立された。
また、リン酸化ニューロフィラメントの被覆率とネクサスが、非リン酸化ニューロフィラメントが検出された場合に得られるよりも低いと判断できる。提案された議定書は遅く、速い筋肉繊維から高品質の神経筋肉接合の準備を得ることを可能にする。シナプス前およびシナプス後の神経筋接合成分を特定のプローブまたは抗体によって同定し、その後共焦点または超解像共焦点顕微鏡で画像化し、マイクロメトリックスケールで形態解析を可能にした。
