Рассечение одиночных волокон скелетных мышц для иммунофлуоресцентного и морфометрического анализа цельно-монтовых нервно-мышечных соединений. Это видео продемонстрирует протокол для эффективного и безопасного рассечения EDL и камошистых мышц с повторяемым подходом. Это видео также научит, как получить полностью установленные нервно-мышечные соединения с целью распознавания синаптических компонентов с 3D-целостностью, чтобы обеспечить точный морфометрический анализ.
Чтобы рассекать мышцы, нужны эти хирургические инструменты. Чтобы начать процедуру, поместите животное животом лицом вверх. Сделайте начальный разрез с помощью хирургического лезвия между носками по направлению к задним конечностям.
Отшелушите кожу, потянув вверх до тех пор, пока правое колено не обнажится. Чтобы найти EDL, следуйте за сухожилиями стопы к кольцевой связки. Эта связка обвоюет два сухожилия.
Разрежьте связку ножницами Uniband между двумя сухожилиями. Определите сухожилие EDL, подняв оба и посмотрев, какой из них заставляет носки двигаться вверх. Обрежьте сухожилие ножницами.
Удерживая сухожилие биологическим пинцезом, начните медленно отделять мышцу EDL от других мышц задних конечностей. Разделение мышцы без повреждения может быть сделано путем проведения различных разрезов на остальных боковых мышцах, чтобы открыть путь между ними, одновременно удерживая и поднимая мышцу из раскалывающегося участка сухожилия EDL. Чтобы полностью изолировать мышцу, отрежьте сухожилие, которое прикреплено к колену крысы, с помощью ножниц Uniband.
Погрузите рассеченную мышцу в фиксаторный раствор, и оставьте ее на 24 часа при четырех градусах Цельсия. В общем, полезно иметь удлиненные мышцы. Для этого используйте картон и скобы, чтобы прикрепить мышцу для фиксации.
Чтобы изолировать камообную мышцу, переверните животное. Через кожу разрезают сухожилие велотряной кисти хирургическим лезвием. С помощью биологического пинцета и ножниц Uniband отделяют икроножную мышцу от костей, создавая мышечное веко.
Камбоя будет находиться на внутренней стороне мышечного укупочной крышки. Его можно идентифицировать, потому что он красный и плоский. С помощью пары биологических пинцетов достигните и поднимите камабистый сухожилие, которое лежит над надземным икроном.
Обрежьте сухожилие ножницами Uniband. Поднимите всю мышцу, разрезая некоторые слабые точки крепления. Наконец, чтобы полностью освободить камушную мышцу, отрежьте камушный жизикул, который образует сухожилие векнатальной кисти.
Повторите этап фиксации, как это сделано с мышцей EDL. Чтобы использовать этот метод, важно закрепить скобы на сухожилиях, а не на мышцах. Как только 24-часовой период фиксации пройдет, промыть мышцы в растворе DPBS, прежде чем начать изолировать мышечные волокна.
Для того чтобы изолировать волокна, аккуратно удерживайте одно из сухожилий одной парой биологических пинцетов. Затем с помощью другой пары биологических пинцетов начните медленно защемлять сухожилие, чтобы отделить мышечные волокна. Чтобы изолировать волокна, медленно потяните вверх к противоположному мышечному сухожилию.
Необходимо будет повторить это действие несколько раз до получения множественных, небольших, изолированных пучков. После разделения на небольшие изолированные пучки аккуратно поместите их в предварительно обработанный силанизированный слайд. Необходимо держать все волокна в порядке, чтобы они не перекрывались.
В этот момент волокна можно оставить сушиться на воздухе в течение 24 часов. Через 24 часа начинают иммуноокрашивание. Чтобы создать водонепроницаемый барьер, используйте ручку PAP, чтобы окружить изолированные мышечные волокна в предварительно обработанный слайд.
Это пример конфокального изображения высокого разрешения, которое можно получить по протоколу, описанной здесь. В левом верхнем углу показан постсинаптический элемент, а в правом верхнем углу — пресинаптический элемент, в то время как на нижних изображениях показаны синаптические компоненты, схематизированные для иллюстрации параметров, которые будут использоваться для морфометрического анализа. На втором слайде показано слияние пре- и постсинаптических сигналов с окрашиванием ядер API.
Различия между нервно-мышечными соединениями трансгенных животных и нетрансгенных животных хорошо видны. Морфометрический анализ нервно-мышечных соединений показывает признаки постсинаптического сигнала у трансгенных животных и представляется более компактным, в основном из-за уменьшения общей площади нервно-мышечного соединения. Как показано здесь, нервно-мышечное соединение пресинаптической области трансгенного животного уменьшается.
Наименьшим обнаруженным был тот, который был обнаружен с антифосфорилированного нейрофиламентным сигналом, как показано на рисунке B, например. На последнем изображении показаны результаты, относящиеся к состоянию полностью установленных нервно-мышечных соединений. Используя индекс покрытия, было установлено, что трансгенные нервно-мышечные соединения были обнаружены частично денервированными.
Кроме того, он может определить, что охват и связь фосфорилированного нейрофиламента ниже, чем получено при обнаружении нефосфорилированного нейрофиламента. Предложенный протокол позволяет получать высококачественные препараты нервно-мышечного соединения из медленных и быстрых мышечных волокон. Компоненты пред- и постсинаптического нервно-мышечного соединения были идентифицированы специфическими зондами или антителами, а затем визуализированны в конфокальной или конфокальной микроскопии сверхвысокального разрешения, что позволило проводить морфометрический анализ в микрометрическом масштабе.
