Dissecção de fibras musculares esqueléticas únicas para análises imunofluorescentes e morfométricas de junções neuromusculares de montagem inteira. Este vídeo demonstrará um protocolo para dissecar os músculos EDL e soleus de forma eficaz e segura com uma abordagem repetível. Este vídeo também ensinará como obter junções neuromusculares de montagem total com o objetivo de reconhecer componentes sinápticos com integridade 3D para permitir uma análise morfométrica precisa.
Para dissecar os músculos, esses instrumentos cirúrgicos são necessários. Para iniciar o procedimento, coloque o animal com o abdômen voltado para cima. Faça uma incisão inicial usando uma lâmina cirúrgica entre os dedos dos dedos dos membros traseiros.
Retire a pele, puxando para cima até que o joelho direito seja exposto. Para encontrar o EDL, siga os tendões do pé até o ligamento anular. Este ligamento circunda dois tendões.
Corte o ligamento com a tesoura Uniband entre os dois tendões. Identifique o tendão edl levantando ambos e vendo qual deles faz os dedos se moverem para cima. Corte o tendão com uma tesoura.
Enquanto segura o tendão com pinças biológicas, comece a separar lentamente o músculo EDL dos outros músculos do membro traseiro. A separação do músculo sem causar danos pode ser feita fazendo vários cortes no resto dos músculos laterais para abrir um caminho entre eles, enquanto segura e levanta o músculo da parte de divisão do tendão edl. Para isolar completamente o músculo, corte o tendão que está preso ao joelho do rato usando uma tesoura Uniband.
Mergulhe o músculo dissecado na solução fixativa, e deixe-o por 24 horas a quatro graus Celsius. Em geral, é útil ter um músculo alongado. Para isso, use papelão e grampos para fixar o músculo para fixação.
Para isolar o músculo soleus, vire o animal. Através da pele, corte o tendão calcâneo usando uma lâmina cirúrgica. Com a ajuda da pinça biológica e da tesoura Uniband, separe o músculo gastrocnemius dos ossos, criando uma tampa muscular.
O soleus estará no lado interno da tampa muscular. Pode ser identificado porque é vermelho e plano. Com um par de pinças biológicas, alcance e levante o tendão do soleus que fica acima do gastrocnemius.
Corte o tendão com uma tesoura Uniband. Levante todo o músculo enquanto corta alguns dos pontos fracos de fixação. Finalmente, para libertar completamente o músculo soleus, corte a vesícula soleus que forma o tendão calcâneo.
Repita a etapa de fixação como feito com o músculo EDL. Para usar este método, é importante fixar os grampos nos tendões e não no músculo. Uma vez passado o período de fixação de 24 horas, enxágue os músculos na solução DPBS antes de começar a isolar as fibras musculares.
Para isolar as fibras, segure suavemente um dos tendões com um par de pinças biológicas. Em seguida, com o outro par de pinças biológicas, comece a lentamente beliscar o tendão para separar as fibras musculares. Para isolar as fibras, puxe lentamente para cima em direção ao tendão muscular oposto.
Será necessário repetir essa ação várias vezes até obter múltiplos, pequenos e isolados pacotes. Uma vez separados em pequenos feixes isolados, coloque-os cuidadosamente em um slide silanizado pré-tratado. É necessário manter todas as fibras ordenadas para que elas não se sobreponham.
Neste ponto, as fibras podem ser deixadas para secar ao ar por 24 horas. Depois de 24 horas, comece a imunossuagem. Para criar uma barreira impermeável, use uma caneta PAP para cercar as fibras musculares isoladas no slide pré-tratado.
Este é um exemplo de uma imagem confocal de alta resolução que pode ser obtida seguindo o protocolo descrito aqui. No canto superior esquerdo, o elemento pós-sináptico é mostrado, e no canto superior direito, o elemento pré-sináptico, enquanto as imagens inferiores mostram os componentes sinápticos esquematizados a fim de ilustrar os parâmetros que serão usados para análise morfométrica. O segundo slide mostra a fusão dos sinais pré e pós-sinápticos com a mancha de núcleo da API.
As diferenças entre as junções neuromusculares de animais transgênicos e animais não transgênicos são claramente visíveis. A análise morfométrica das junções neuromusculares mostra evidências do sinal pós-sináptico em animais transgênicos e parece ser mais compacta, principalmente devido à redução da área total da junção neuromuscular. Como mostrado aqui, a junção neuromuscular área pré-sináptica do animal transgênico é reduzida.
O menor detectado foi o encontrado com sinal de neurofilamento antifosforylated, como mostrado na imagem B, por exemplo. A última imagem mostra os resultados relativos ao estado das junções neuromusculares de montagem total. Utilizando o índice de cobertura, foi estabelecido que as junções neuromusculares transgênicas foram encontradas parcialmente denervadas.
Além disso, pode determinar que a cobertura e o nexo do neurofilamento fosfoilado é menor do que o obtido quando um neurofilamento não fosfoilado é detectado. O protocolo proposto permite obter preparações de junção neuromuscular de alta qualidade a partir de fibras musculares lentas e rápidas. Os componentes de junção neuromuscular pré e pós-sináptica foram identificados por sondas ou anticorpos específicos e, em seguida, retratados em microscopia confocal ou super-resolução, permitindo a análise morfométrica em escala micrométrica.
