Este protocolo para um sistema de expressão proteica livre de células recombinantes, comumente conhecido como sistema PURE, utiliza a cultura celular e a purificação celular para agilizar as purificações proteicas necessárias. Isso minimiza significativamente os requisitos de tempo e trabalho. O método OnePot provou ser não apenas econômico, mas também eficiente no tempo.
Reduz o tempo de preparação de várias semanas para três dias úteis. Isso torna a plataforma sem células PURE acessível a mais laboratórios em todo o mundo e ajuda a implementar essa plataforma realmente poderosa para biologia livre de células sintéticas. Antes de começar, certifique-se de que todas as cepas expressam bem suas respectivas proteínas.
Para começar, prepare a coluna para a purificação de proteínas OnePot, conforme descrito no manuscrito do texto usando dois mililitros de resina sepharose, e, em seguida, carregue a coluna com sulfato de níquel. Prepare as culturas iniciais combinando 20 mililitros de mídia LB com 20 microliters de ampicilina. Adicione 300 microliters da mídia em 35 poços de uma placa de poço estéril de 96.
Inocular cada um deles com sua respectiva cepa, exceto fator de alongamento termo instável, ou EFTU, e selar a placa com uma membrana respirável. Para a cultura EFTU, inocularei três mililitros de ampicillina contendo mídia LB em um tubo de cultura de 14 mililitros com uma tampa de estalo. Cerca de três mililitros da cultura EFTU são suficientes para uma cultura de expressão OnePot.
Incuba-o a 37 graus Celsius enquanto treme a 260 rotações por minuto durante a noite. No dia seguinte, transfira 500 mililitros de mídia LB e 500 microliters de ampicilina para o frasco estéril perplexo. Inocular a cultura OnePot PURE com 1.675 microliters da cultura EFTU e 55 microliters de cada uma das culturas do prato do poço profundo.
Incubar a cultura por duas horas a 37 graus Celsius com um tremor de 260 rotações por minuto, ou até que a densidade óptica da cultura atinja 0,2 a 0,3. Induzir a cultura com 500 microlitres de 0,1 milimólar IPTG e crescer por mais três horas. Colher as células por centrifugação a quatro graus Celsius e 3.220 vezes G por 10 minutos, e armazenar a pelota de célula a menos 80 graus Celsius até uso posterior.
No terceiro dia, meça as quantidades de buffers necessários para sua purificação e adicione TCEP a todos eles conforme indicado no texto. Armazene os buffers restantes sem TCEP a quatro graus Celsius para futuras purificações. Equilibre a coluna carregada com 30 mililitros de buffer A.Depois que 25 mililitros de buffer A tiver passado, feche a coluna a partir da parte inferior.
Descongele as células e use uma pipeta sorológica para resuspensar a pelota celular em 7,5 mililitros de tampão A.Lyse as células usando uma sonda de 130 watts. Se a sônica for bem sucedida, a solução ficará mais escura. Certifique-se de manter as células no gelo e colocar a sonda profunda o suficiente sem tocar no tubo.
Remova os detritos celulares por centrifugação a 21, 130 vezes G por 20 minutos a quatro graus Celsius e mantenha o lysate no gelo. Adicione o supernatante à coluna equilibrada. Feche a coluna do topo e certifique-se de que não há vazamento.
Incubar a coluna por três horas a quatro graus Celsius em rotação usando um rotador de tubo. Elute desvincula componentes da coluna e lave com 25 mililitros de tampão A.Lave a coluna com 25 mililitros de 25 mililitros de tampão imidazol. Elute as proteínas com cinco mililitros de 450 milimidazol tampão e mantenha as proteínas elucidadas no gelo o tempo todo.
Diluir o elunato com 25 mililitros de tampão HT e manter a mistura no gelo. Adicione 15 mililitros a um filtro centrífugo de 15 mililitros e concentre-se em um volume de 1,5 mililitros. Adicione os 15 mililitros restantes ao filtro com a solução concentrada e concentre-se em 1,5 mililitros mais uma vez.
Adicione 10 mililitros de tampão HT à amostra concentrada e concentre-se em um mililitro. Recupere a amostra concentrada e adicione uma quantidade igual de tampão de estoque B e armazene a menos 80 graus Celsius até que seja usado. Durante a troca de buffer, restaure a coluna conforme especificado no texto.
No quarto dia, meça a concentração de proteínas usando o ensaio de Bradford. Concentre a amostra com 0,5 mililitros de três kilodalton cortar filtro centrífugo a 20 miligramas por mililitro. Verifique a composição proteica OnePot PURE usando a página SDS.
Diluir 2,5 microliters da amostra com 7,5 microliters de água misturados com 10 microliters de dois tampão X Laemmli, e então carregar cinco microlitres e 2,5 microlitres das amostras no gel. Execute a página SDS conforme especificado no texto. Preencha a concentração e o comprimento do DNA nas células amarelas correspondentes na planilha usando de 2 a 10 nanomolar de DNA para a reação.
Preencha o volume total de reação desejado em microliters. Retire os reagentes necessários do congelador e descongele-os no gelo. Em seguida, pipeta as quantidades calculadas de água, DNA e solução de energia para um lado do tubo PCR ou um canto de um poço na placa 384.
Pipeta as quantidades calculadas de proteína e solução ribossosome para o outro lado de um tubo PCR ou o canto oposto da placa 384. Gire por cerca de 30 segundos para mesclar os componentes de reação. Para evitar a evaporação durante os experimentos do leitor de placas, adicione 35 microliters de cera líquida e sele a placa com um selante transparente.
Incubar por um mínimo de três horas a 37 graus Celsius. Para leitura em um leitor de placas, meça a intensidade de floresnce no comprimento de onda necessário a cada dois minutos. O sucesso sobre a expressão em todas as cepas individuais usadas posteriormente para a preparação da proteína OnePot é mostrado aqui.
A composição geral da última solução de proteína OnePot PURE foi analisada pela página da SDS. É perceptível que o EFTU está presente em uma maior concentração em comparação com as outras proteínas, como esperado. Os rendimentos da síntese da solução proteica OnePot combinada com os ribossomos não marcados ou não marcados foram analisados pelo monitoramento da fluorescência eGFP ao longo do tempo.
Os níveis de expressão de três proteínas diferentes rotuladas usando o sistema de rotulagem in vitro tRNA da lista verde, ou mancha kumasi, foram analisados em um gel de página SDS. Para um sistema PURE funcional, é absolutamente crítico que todas as cepas expressem bem suas respectivas proteínas. Essa técnica facilita a implantação do sistema PURE à engenharia do sistema biológico, possibilitando o desenvolvimento de novas redes genéticas, diagnósticos moleculares, terapêuticas e kits educacionais.
