Ce protocole décrit des méthodes pour visualiser les morphologies de la colonne vertébrale dendritique et les transitoires de calcium dans les neurones de C. elegans. Notre approche devrait faciliter les approches génétiques pour découvrir les déterminants de la morphogenèse et de la fonction d’une colonne vertébrale. Notre protocole comporte des épines dendritiques dans les neurones GABAergiques.
Les épines dans d’autres classes de neurones C. elegans peuvent également être étudiées avec ces méthodes. Notre protocole décrit des méthodes pour immobiliser C.elegans vivant. Il est particulièrement important d’empêcher les mouvements des animaux lors de l’acquisition d’images et de choisir les bonnes configurations laser pour exciter et enregistrer l’activité neuronale.
Pour obtenir des images haute résolution, ajoutez trois microlitres de solution anesthésique et ajoutez 15 à 20 vers jeunes adultes sur des tampons d’agarose à 10%. Appliquez ensuite le couvercle pour immobiliser les vers et scellez les bords du couvercle avec un mélange de scellant adhésif fondu. Pour une acquisition en super-résolution, utilisez un microscope confocal à balayage laser équipé d’une microscopie à super-résolution.
Acquérir des piles Z en utilisant la taille de pas recommandée par le logiciel du fabricant. Collectez une série de coupes optiques qui couvrent le volume total du processus ventral dorsal D ou DD. Soumettez les piles Z pour le traitement d’image à l’aide du logiciel du fabricant et analysez les images avec un score supérieur à sept.
Pour l’acquisition de Nyquist, utilisez un microscope confocal à balayage laser et sélectionnez la taille de pixel optimale pour la longueur d’onde de la lumière et l’ouverture numérique de l’objectif. Soumettez ensuite la pile pour la déconvolution 3D à l’aide d’un algorithme automatique. Pour l’analyse d’image, utilisez un logiciel de traitement d’image approprié pour créer des projections d’intensité maximale des piles Z.
Et compter manuellement les protubérances sur la dendrite DD. Ensuite, déterminez la longueur de la dendrite DD notée pour calculer la densité des épines par 10 micromètres de dendrite DD. Ensuite, classez les épines comme minces ou champignons, filopodiales, trapues ou ramifiées.
En utilisant des techniques conventionnelles telles que la micro-injection, créer des vers transgéniques exprimant le capteur de calcium GCaMP dans les neurones DD, et Chrimson, un canal rhodopsine décalé vers le rouge dans les neurones VA présynaptiques. Ensuite, sous un capot laminaire, préparez toutes les plaques trans-rétiniennes ou ATR en ajoutant 300 microlitres de culture bactérienne OP50 cultivée pendant la nuit et 0,25 microlitre d’ATR à chaque plaque de gélose nutritive de milieu de croissance des nématodes de 60 millimètres. Ensuite, étaler la culture avec une tige de verre stérile.
Pour les plaques de contrôle, ajoutez 300 microlitres de bactéries OP50 et 0,25 microlitres d’éthanol. Pour permettre la croissance bactérienne, incuber les plaques à température ambiante pendant 24 heures, à l’abri de la lumière ambiante. Pour mettre en place l’expérience, placez cinq larves du stade L4 sur des plaques ATR ou témoins ensemencées OP50 et incuber les plaques dans l’obscurité à 23 degrés Celsius.
Après trois jours, utilisez un microscope à dissection stéréoscopique pour confirmer le développement de la vulve et choisissez la descendance du stade L4 dans l’ATR et les plaques de contrôle pour l’imagerie. Ensuite, placez deux microlitres de polybilles de 0,05 micromètre sur une lame de microscope. Et placez environ 10 larves L4 dans la solution.
À l’aide d’un fil de platine, ajoutez un petit globule de super colle à la solution. Remuez doucement la solution pour générer des brins filamenteux de colle. Ajoutez ensuite trois microlitres de tampon M9.
Appliquez ensuite un bordereau de couverture et scellez ses bords comme démontré précédemment. Pour enregistrer les transitoires de calcium évoqués dans les épines dendritiques, utilisez un microscope confocal à disque rotatif et ajustez l’étage du microscope pour positionner les épines DD dans le plan focal. Ensuite, configurez l’acquisition accélérée pour éclairer l’échantillon avec une ligne laser de 488 nanomètres dans chaque image pour détecter la fluorescence GCaMP, et une ligne laser de 561 nanomètres à intervalles périodiques pour l’excitation de Chrimson.
Pour l’imagerie calcique in vivo, utilisez la déconvolution 2D et l’alignement de l’image pour corriger les écarts mineurs par rapport au mouvement du ver pendant l’acquisition. Ensuite, définissez la colonne vertébrale dendritique DD comme la région d’intérêt ou le retour sur investissement. Dupliquez le retour sur investissement et déplacez-vous vers une région voisine à l’intérieur du ver pour collecter le signal d’arrière-plan.
Ensuite, à l’aide d’un logiciel approprié, exportez les intensités GFP vers Excel pour chaque point temporel et soustrayez la fluorescence de fond de la fluorescence ROI de la colonne vertébrale. Déterminez le changement de fluorescence en soustrayant la fluorescence GFP dans le cadre immédiatement avant l’excitation nanométrique 561 ou à zéro à partir de chaque point temporel après excitation ou Delta F.Puis divisez par F zéro pour déterminer Delta F sur F zéro. Et représenter graphiquement les traces normalisées.
Tout d’abord, déterminez si les données sont normalement distribuées à l’aide d’un test de Shapiro-Wilk. Pour les données qui ne sont pas normalement distribuées, utilisez une ANOVA non paramétrique avec correction post-hoc pour les tests multiples. Alternativement, pour les mesures montrant une distribution normale ou gaussienne, effectuer un test ANOVA paramétrique apparié pour chaque mesure de la fluorescence GCaMP avant et après chaque impulsion de 561 nanomètres.
Et corriger pour les comparaisons multiples dans chacun des deux groupes. Le marquage des épines dendritiques DD avec trois marqueurs indépendants, cytosolic mCherry, MYR:mRuby et LifeAct:GFP a donné une densité moyenne de 3,4 épines dendritiques DD par 10 microns de dendrite DD chez les jeunes adultes de type sauvage. Le marqueur GFP:Utrophin a été exclu de cette analyse car il a donné une densité de colonne vertébrale significativement plus faible, potentiellement due aux interactions de l’utrophine avec le cytosquelette d’actine qui entraîne la morphogenèse de la colonne vertébrale.
L’approche d’imagerie des cellules vivantes a confirmé que la morphologie mince en forme de champignon des épines DD prédomine chez l’adulte par rapport à d’autres formes de colonne vertébrale comme filopodiale, trapue et ramifiée. L’activation des épines dendritiques DD a été évaluée par signalisation cholinergique présynaptique chez les vers transgéniques exprimant GCaMP dans les neurones DD et Chrimson dans les neurones VA présynaptiques. Des rafales transitoires de signal GCaMP ont été détectées dans les épines DD immédiatement après l’activation optogénétique de Chrimson dans les neurones VA présynaptiques.
Une expérience de contrôle en l’absence d’ATR a confirmé que la mesure du signal GCaMP dépend de l’activation optogénétique de Chrimson, qui dépend strictement de l’ATR. Pour visualiser les épines DD, il est préférable d’imaginer les animaux couchés sur le côté, tels que les épines qui dépassent sont perpendiculairement au chemin de la lumière. Avec cette méthode, les scientifiques peuvent également utiliser des manipulations pharmacologiques pour comprendre les mécanismes qui entraînent les transitoires de calcium dans les épines DD.
