Este protocolo descreve métodos para visualização das morfologias da coluna dendrítica e dos transientes de cálcio em neurônios de C.elegans. Nossa abordagem deve facilitar abordagens genéticas para descobrir determinantes da morfogênese e função de uma coluna vertebral. Nosso protocolo apresenta espinhas dendríticas em neurônios GABAérgicos.
Espinhas em outras classes de neurônios C.elegans também podem ser investigadas com esses métodos. Nosso protocolo descreve métodos para imobilizar C.elegans vivos. É particularmente importante prevenir o movimento dos animais durante a aquisição da imagem e escolher as configurações de laser corretas para excitar e registrar a atividade neuronal.
Para adquirir imagens de alta resolução, adicione três microlitros de solução anestésica e quantidade de 15 a 20 vermes adultos jovens em almofadas de 10% de agarose. Em seguida, aplique a folha de cobertura para imobilizar os vermes e sele as bordas da folha de cobertura com uma mistura de selante adesivo derretido. Para uma aquisição de super-resolução, use um microscópio confocal de varredura a laser equipado com microscopia de super-resolução.
Adquira Pilhas Z usando o tamanho de etapa recomendado pelo software do fabricante. Colete uma série de seções ópticas que abrangem o volume total do processo ventral Dorsal D ou DD. Envie as pilhas Z para processamento de imagens usando o software do fabricante e analise imagens com uma pontuação superior a sete.
Para a aquisição de Nyquist, use um microscópio confocal de varredura a laser e selecione o tamanho ideal de pixel para o comprimento de onda da luz e abertura numérica da lente objetiva. Em seguida, envie a pilha para deconvolução 3D usando um algoritmo automático. Para análise de imagem, use um software de processamento de imagem apropriado para criar projeções de intensidade máxima das pilhas Z.
E conte manualmente as saliências no dendrito DD. Em seguida, determine o comprimento do dendrito DD pontuado para calcular a densidade dos espinhos por 10 micrômetros de dendrito DD. Em seguida, classifique os espinhos como finos ou cogumelos, filopodiais, teimosos ou ramificados.
Usando técnicas convencionais, como microinjeção, criar vermes transgênicos expressando o sensor de cálcio GCaMP em neurônios DD, e Chrimson, uma rodopsina de canal deslocado para o vermelho em neurônios VA pré-sinápticos. Em seguida, sob um exaustor laminar, prepare todas as placas trans-retinianas ou ATR adicionando 300 microlitros de cultura bacteriana OP50 cultivada durante a noite e 0,25 microlitros de ATR a cada placa de ágar nutriente de 60 milímetros do meio de crescimento de nematoides. Em seguida, espalhe a cultura com uma haste de vidro estéril.
Para placas de controle, adicione 300 microlitros de bactérias OP50 e 0,25 microlitros de etanol. Para permitir o crescimento bacteriano, incube as placas à temperatura ambiente durante 24 horas, protegidas da luz ambiente. Para configurar o experimento, coloque cinco larvas de estágio L4 em ATR ou placas de controle com sementes de OP50 e incube as placas no escuro a 23 graus Celsius.
Após três dias, use um microscópio de dissecação estéreo para confirmar o desenvolvimento da vulva e escolha a progênie do estágio L4 do ATR e das placas de controle para imagens. Em seguida, coloque dois microlitros de poliesferas de 0,05 micrômetro em uma lâmina de microscópio. E coloque aproximadamente 10 larvas L4 na solução.
Usando um fio de platina, adicione um pequeno glóbulo de super cola à solução. Gire a solução suavemente para gerar filamentos de cola. Em seguida, adicione três microlitros de buffer M9.
Em seguida, aplique um deslizamento de tampa e sele suas bordas como demonstrado anteriormente. Para registrar os transientes de cálcio evocados nas espinhas dendríticas, use um microscópio confocal de disco giratório e ajuste o estágio do microscópio para posicionar as espinhas DD no plano focal. Em seguida, configure a aquisição de lapso de tempo para iluminar a amostra com uma linha de laser de 488 nanômetros em cada quadro para detectar a fluorescência GCaMP e uma linha de laser de 561 nanômetros em intervalos periódicos para excitação de Chrimson.
Para imagens de cálcio in vivo, use a deconvolução 2D e o alinhamento da imagem para corrigir pequenos desvios do movimento do verme durante a aquisição. Em seguida, defina a coluna dendrítica DD como a região de interesse ou ROI. Duplique o ROI e realoque para uma região vizinha dentro do worm para coletar o sinal em segundo plano.
Em seguida, usando o software apropriado, exporte as intensidades de GFP para o Excel para cada ponto de tempo e subtraia a fluorescência de fundo da fluorescência do ROI da coluna. Determine a mudança na fluorescência subtraindo a fluorescência GFP no quadro imediatamente antes da excitação de 561 nanômetros ou a zero de cada ponto de tempo após a excitação ou Delta F.Em seguida, divida por F zero para determinar Delta F sobre F zero. E representar graficamente os traços normalizados.
Primeiro, determine se os dados são normalmente distribuídos usando um teste de Shapiro-Wilk. Para dados que normalmente não são distribuídos, use uma ANOVA não paramétrica com correção post-hoc para testes múltiplos. Alternativamente, para medições que mostrem distribuição normal ou gaussiana, execute um teste de ANOVA paramétrica emparelhada para cada medição de fluorescência GCaMP antes e depois de cada pulso de 561 nanômetros.
E corrija comparações múltiplas em cada um dos dois grupos. A marcação de espinhos dendríticos DD com três marcadores independentes, mCherry citosólico, MYR:mRuby e LifeAct:GFP produziu uma densidade média de 3,4 espinhos dendríticos DD por 10 mícrons de dendrito DD em adultos jovens do tipo selvagem. O marcador GFP:Utrophin foi excluído desta análise porque produziu uma densidade de coluna significativamente menor, potencialmente devido a interações de utrofina com o citoesqueleto de actina que impulsiona a morfogênese da coluna.
A abordagem de imagem de células vivas confirmou que a morfologia fina em forma de cogumelo dos espinhos DD predomina no adulto em comparação com formas alternativas de coluna vertebral, como filopodial, teimosa e ramificada. A ativação de espinhas dendríticas DD foi avaliada por sinalização colinérgica pré-sináptica em vermes transgênicos expressando GCaMP em neurônios DD e Chrimson em neurônios VA pré-sinápticos. Explosões transitórias de sinal GCaMP foram detectadas em espinhas DD imediatamente após a ativação optogenética de Chrimson em neurônios AV pré-sinápticos.
Um experimento de controle na ausência de ATR confirmou que a medida para o sinal GCaMP depende da ativação optogenética de Chrimson, que é estritamente dependente de ATR. Para visualizar os espinhos DD, é melhor visualizar animais deitados de lado, como os espinhos que se projetam em ângulos retos para o caminho da luz. Com este método, os cientistas também podem usar manipulações farmacológicas para entender os mecanismos que impulsionam os transientes de cálcio nas espinhas DD.
