هذا البروتوكول سهلة الأداء يقيم فعالية مضادة للبكتيريا من تركيبات البكتيريا المتنوعة، والمعروفة أيضا باسم الكوكتيلات phage، في ظل ظروف مختلفة في بيئة عالية الإنتاجية. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على تيار العوامل الحيوية والأبايوتية المختلفة، مثل درجة الحرارة، التي قد تؤثر على فعالية phage في ظل مجموعة من الظروف البيئية. يمكن أن تسهل هذه الطريقة تصميم كوكتيلات phage المناسبة لتعزيز التحكم الحيوي والنتائج العلاجية وتحديد التفاعل بين المضيفين البكتيريين والبكتيريا.
في البداية، قم بإعداد المقايسة الدقيقة باستخدام نصائح تمت تصفيتها لتجنب التلوث المتبادل. أولا، إضافة 180 ميكرولتر من mTSB في آبار الأعمدة 1-12 من اللوحة الدقيقة 96 جيدا، ثم إعداد تخفيفات عشرة أضعاف المسلسل من كل phage في أعمدة 1-8 من لوحات صغيرة عقيمة 96 جيدا لإعداد المقايسة. إضافة 20 ميكرولتر من phages الفردية أو الكوكتيلات phage إلى الآبار 1-8 من الصف العلوي A من لوحة صغيرة.
للتحكم الخالي من ال phage والفارغ، أضف 20 ميكرولتر من mTSB إلى البئر العلوي للأعمدة من 9 إلى 12. أثناء الأنابيب، اخلطي محتويات البئر مع الطموح اللطيف والمتكرر خمس مرات على الأقل وغيري النصائح بين التخفيفات. إزالة 20 ميكرولتر من الصف الأخير H، ثم إعداد خزان للسلالة البكتيرية اختبارها عن طريق نقل 2-3 ملليلتر من الثقافة المخففة في الخزان باستخدام ماصة ملليلتر واحد.
باستخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة 20 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية المخففة إلى كل بئر في الأعمدة 1-10 مع تغيير النصائح بين كل إضافة. تغطية واحتضان لوحة صغيرة في 37 درجة مئوية. على فترات ساعتين، قم بإزالة اللوح الصغير من الحاضنة واقرأ اللوحة باستخدام قارئ لوحة صغيرة.
بدلا من ذلك، احتضان لوحة في قارئ microplate وقراءتها مع مرور الوقت. لفحص الكثافة البصرية في 600 نانومتر باستخدام قارئ لوحة صغيرة، افتح البرنامج على قارئ لوحة صغيرة. حدد الوضع البسيط في إطار خيارات بدء التشغيل ثم حدد إنشاء بروتوكول جديد في إدارة المهام.
من نافذة نوع لوحة حدد، اختر لوحة 96 جيدا من القائمة المنسدلة. كطريقة للكشف، حدد الامتصاص لنوع القراءة، وحدد Endpoint/Kinetic option لنوع البصريات، وحدد Monochromators، ثم انقر فوق موافق. لقراءة الخطوة، أدخل 600 نانومتر للأطوال الموجية، حدد عادي لسرعة القراءة وانقر OK.To تعيين درجة الحرارة للمقايسة، انقر على خانة الاختيار حضانة وحدد حاضنة On.Enter درجة الحرارة المطلوبة في مربع درجة الحرارة ومن ثم انقر فوق موافق. انقر على سخن قبل الاستمرار في الخطوة التالية خانة الاختيار لدرجة حرارة الحضانة 37 درجة مئوية، على الرغم من أن الخيار غير مطلوب لظروف الاختبار في 22 درجة مئوية. لمنع التكثيف على غطاء اللوحة أثناء الحضانة، قم بتعيين تدرج درجة الحرارة بإدخال قيمة في مربع التدرج ثم انقر فوق موافق. بعد ذلك، انقر على خانة الاختيار الحركية لفتح الإعداد الحركي.
تعيين وقت التشغيل لمدة 10 ساعات ل37 درجة مئوية حضانة أو 22 ساعة لدرجة حرارة الغرفة وأدخل ساعتين كما الفاصل الزمني للقراءة، ثم انقر على موافق. انقر على خانة الاختيار اهتزاز في إطار الإجراء لإعداد حالة اهتزاز، إذا لزم الأمر لكل قراءة الحركية. حدد الخطي كوضع اهتزاز وتغيير المدة إلى 30 ثانية. تعيين قيمة التردد الخطي إلى 731 دورة في الدقيقة، ثم انقر فوق OK.In إطار "حوار ملخص البروتوكول"، انقر فوق تخطيط لوحة، حدد الفراغات، عناصر التحكم المقايسة، ونماذج، وانقر فوق التالي.
بعد تحديد إعدادات كل نوع جيد، انقر على إنهاء. حدد معرفا جيدا في واجهة الجانب الأيسر، وعينه للمصفوفة الموضحة في نافذة تخطيط اللوحة، ثم انقر فوق موافق. انقر على زر قراءة لوحة، حفظ البروتوكول كملف prt وانقر على حفظ. إدراج لوحة وانقر على موافق. بمجرد الانتهاء من التجربة، حفظ التجربة كملف xpt وانقر على حفظ.
تصدير البيانات إلى Excel بالنقر فوق الزر نعم في مربع إطار الرسالة لمزيد من التحليل. انقر على الاختيار حفظ نعم /لا، ولا تسأل مرة أخرى لحفظ الأفضلية. بعد البروتوكول ، تم إجراء مقارنة بين فعالية phage وتركيبات phage المختلفة ، ودرجات الحرارة ، والأوقات ، وتعدد العدوى ، أو MOIs.
وبناء على هذا التحليل، تم تعظيم فعالية phage المضادة O157 بعد 14، 16، أو 18 ساعة من الحضانة في 22 درجة مئوية. لفهم الحركية قتل phage من البكتيريا، تم رسم قيم OD في 600 نانومتر ضد وقت أخذ العينات، MOIs، والعلاج phage. تظهر منحنيات النمو البكتيري التمثيلي عند 37 درجة مئوية المعالجة.
T4 منعت تماما النمو البكتيري في كل وقت أخذ العينات حتى في وزارة الداخلية منخفضة. لتحليل phage أعاقت النمو البكتيري ، تم رسم قيم OD المتوسطة من جميع MOIs مقابل كل وقت أخذ العينات وعلاج phage. وكشفت الرسوم البيانية التمثيلية في درجتي حرارة أن فعالية قتل الفواج، على سبيل المثال، بالنسبة ل T1 plus T4 تم تعزيزها عند 22 درجة مئوية مقارنة ب 37 درجة مئوية.
وتظهر مقارنة فعالية phage الشاملة، مما يسهل تحديد أفضل مرحلة العلاج. على سبيل المثال، بالنسبة لسلالة الإشريكية القولونية 3081، كان العلاج بالفاج T4 و T5 زائد T4 العلاج الأكثر فعالية عند 37 درجة مئوية. ومع ذلك ، في 22 درجة مئوية ، بالإضافة إلى T4 ، كان phage T1 بالإضافة إلى T4 و T1 بالإضافة إلى T4 بالإضافة إلى rV5 ، وأربعة كوكتيلات phage فعالة.
عند تنفيذ هذا الإجراء، pipetting دقيقة للغاية، لا سيما عند استخدام ماصة متعددة القنوات وتوحيد النهج ضرورية للحصول على نتائج قابلة للمقارنة وقابلة للتفسير. ويلزم إجراء تجارب متابعة لتقييم الأداء الإضافي للكوكتيل الأكثر تأثيرا في الفحص، ومنع ظهور المسوخ المضادة للphage في نظام واسع النطاق لثقافة المرق والمصفوفات البيولوجية الأخرى.
