Bu kolay gerçekleştirilir protokolü, faj kokteylleri olarak da bilinen çeşitli bakteriyofaj kombinasyonlarının antibakteriyel etkinliğini, yüksek verimli bir ortamda farklı koşullar altında değerlendirir. Tekniğin temel avantajları, bir dizi çevresel koşulda faj etkinliğini etkileyebilecek sıcaklık gibi farklı biyotikleri ve abiyotik faktörleri akışa alma yeteneğidir. Bu yöntem, biyokontrol ve terapötik sonuçları iyileştirmek ve bakteriyel konaklar ile bakteriyofajlar arasındaki etkileşimi belirlemek için uygun faj kokteyllerinin tasarımını kolaylaştırabilir.
Başlangıç olarak, çapraz kontaminasyonu önlemek için filtrelenmiş uçları kullanarak mikro plaka testini ayarlayın. İlk olarak, 96 kuyulu mikro plakanın bir ila 12'sine sütunların kuyularına 180 mikrolitre mTSB ekleyin, ardından tahlilleri kurmak için steril 96 kuyu mikro plakalarının bir ila sekizinde her fajın seri on kat seyreltmelerini hazırlayın. Mikro plakanın üst sıra A'sının bir ila sekiz kuyusuna 20 mikrolitre bireysel faj veya faj kokteyli ekleyin.
Fajsız ve boş kontrol için, sütunların üst kuyusuna dokuz ila 12 arasında 20 mikrolitre mTSB ekleyin. Pipetleme yaparken, kuyu içeriğini en az beş kez nazik ve tekrarlanan aspirasyonla karıştırın ve seyreltmeler arasında ipuçlarını değiştirin. Son H sırasından 20 mikrolitre çıkarın, ardından seyreltilmiş kültürün iki ila üç mililitresini bir mililitre pipet kullanarak rezervuara aktararak test edilen bakteri suşu için bir rezervuar kurun.
Çok kanallı bir pipet kullanarak, her ekleme arasında ipuçlarını değiştirirken sütunlardaki her kuyuya 20 mikrolitre seyreltilmiş bakteri kültürü ekleyin. Mikro plakayı 37 santigrat derecede örtün ve kuluçkaya yatırın. İki saat aralıklarla, mikro plakayı inkübatörden çıkarın ve bir mikro plaka okuyucu kullanarak plakayı okuyun.
Alternatif olarak, plakayı bir mikro plaka okuyucusunda kuluçkaya yatırın ve zamanla okuyun. Mikro plaka okuyucu kullanarak 600 nanometredeki optik yoğunluğu incelemek için programı bir mikro plaka okuyucu üzerinde açın. Başlangıç seçenekleri penceresinde Basit Mod'u seçin ve ardından Görev Yöneticisi'nde Yeni Bir Protokol Oluştur'u seçin.
Plaka Türünü Seç penceresinden, açılan listeden 96 kuyu plakasını seçin. Algılama yöntemi olarak, okuma türü için Absorbance'ı seçin, optik türü için Uç Nokta/Kinetik seçeneğini belirleyin, Monokromatörler'i seçin ve Tamam'ı tıklatın. Okuma Adımı için dalga boyları için 600 nanometre girin, okuma hızı için Normal'i seçin ve test için sıcaklığı ayarlamak OK.To tıklayın, Kuluçka onay kutusunu tıklatın ve İnkübatör Açık'ı seçin.Sıcaklık kutusuna istediğiniz sıcaklığı girin ve tamam'ı tıklatın. 37 santigrat derece inkübasyon sıcaklığı için bir sonraki adımla devam etmeden önce Ön Isıt onay kutusunu tıklatın, ancak 22 santigrat derecedeki test koşulları için seçenek gerekli değildir. Kuluçka sırasında plaka kapağındaki yoğuşmayı önlemek için, degrade kutusuna bir değer girerek sıcaklık gradyanını ayarlayın ve Tamam'ı tıklatın. Ardından, kinetik kurulumu açmak için Kinetik onay kutusunu tıklatın.
Çalışma Süresini 37 santigrat derece inkübasyon için 10 saat veya oda sıcaklığı için 22 saat olarak ayarlayın ve okuma aralığı olarak iki saat girin, ardından Tamam'a tıklayın. Her kinetik okuma için gerekirse, sallama koşulu ayarlamak için yordam penceresindeki Salla onay kutusunu tıklatın. Sallama Modu olarak Doğrusal'ı seçin ve Süreyi 30 saniye olarak değiştirin. Doğrusal Frekans değerini dakikada 731 döngüye ayarlayın ve protokol özeti diyaloğu penceresinin OK.In tıklatın, Plaka Düzeni'ne tıklayın, Boşluklar, Test Kontrolleri ve Örnekler'i seçin ve İleri'yi tıklatın.
Her kuyu türünün ayarlarını tanımladıktan sonra Son'a tıklayın. Sol taraftaki arayüzde bir kuyu kimliği seçin, Plaka Düzeni penceresinde gösterilen matrise atayın ve Tamam'a tıklayın. Okuma Plakası düğmesine tıklayın, protokolü bir prt dosyası olarak kaydedin ve Kaydet'e tıklayın. Plakayı takın ve Tamam'ı tıklatın. Deneme tamamlandıktan sonra, denemeyi xpt dosyası olarak kaydedin ve Kaydet'e tıklayın.
Daha fazla çözümleme için ileti penceresi kutusundaki Evet düğmesini tıklatarak verileri Excel'e verin. Evet/Hayır Kaydet seçimine tıklayın ve tercihi kaydetmek için bir daha sorma onay kutusunu tıklatın. Protokolün ardından, faj etkinliğinin çeşitli faj kombinasyonları, sıcaklıklar, zamanlar ve enfeksiyonların çokluğu veya MBI'ler ile karşılaştırılması gerçekleştirildi.
Bu analize dayanarak, anti-O157 faj etkinliği 22 santigrat derecede 14, 16 veya 18 saatlik inkübasyondan sonra en üst düzeye çıkarıldı. Bakterilerin faj öldürme kinetiğini anlamak için, 600 nanometredeki OD değerleri örnekleme süresi, MBI'ler ve faj tedavisine karşı çizildi. Tedavi edilen 37 santigrat derecedeki temsili bakteri üreme eğrileri gösterilmiştir.
T4, düşük MOI'de bile her örnekleme zamanında bakteri üremesini tamamen engelledi. Faj inhibe bakteri üremesini analiz etmek için, tüm MOI'lerden ortalama OD değerleri her örnekleme süresine ve faj tedavisine karşı çizildi. İki sıcaklıkta temsili grafikler, örneğin T1 artı T4 için faj öldürme etkinliğinin 37 santigrat dereceye kıyasla 22 santigrat derecede artırıldığını ortaya koydu.
Genel faj etkinliğinin karşılaştırılması, en iyi faz tedavisinin tanımlanmasını kolaylaştıran gösterilmiştir. Örneğin, Escherichia coli strain 3081 için, T4 ve T5 plus T4 fajları ile tedavi 37 santigrat derecede en etkili tedaviydi. Bununla birlikte, 22 santigrat derecede, T4'e ek olarak, faj T1 artı T4, T1 artı T4 artı rV5 ve dört faj kokteyli etkili oldu.
Bu prosedürü gerçekleştirirken, özellikle çok kanallı pipet kullanırken son derece doğru pipetleme ve yaklaşımın homojenliği karşılaştırılabilir ve yorumlanabilir sonuçlar elde etmek için gereklidir. Taramada en etkili kokteylin daha fazla performansını değerlendirmek için takip deneyleri gereklidir, bu da geniş bir et suyu kültür sisteminde ve diğer biyolojik matrislerde antifaj mutantlarının ortaya çıkmasını önler.
