Dieses einfach durchzuführende Protokoll bewertet die antibakterielle Wirksamkeit verschiedener Bakteriophagenkombinationen, auch bekannt als Phagencocktails, unter unterschiedlichen Bedingungen in einer Hochdurchsatzumgebung. Die Hauptvorteile der Technik sind die Fähigkeit, verschiedene Biotika und abiotische Faktoren wie die Temperatur zu streamen, die die Wirksamkeit von Phagen unter einer Reihe von Umweltbedingungen beeinflussen können. Diese Methode kann die Entwicklung geeigneter Phagencocktails erleichtern, um die Biokontrolle und die therapeutischen Ergebnisse zu verbessern und die Interaktion zwischen bakteriellen Wirten und Bakteriophagen zu bestimmen.
Richten Sie zunächst den Mikrotiterplattenassay mit gefilterten Spitzen ein, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Fügen Sie zuerst 180 Mikroliter mTSB in die Vertiefungen der Spalten eins bis 12 der 96-Well-Mikroplatte hinzu und bereiten Sie dann serielle zehnfache Verdünnungen jedes Phagen in den Spalten eins bis acht der sterilen 96-Well-Mikroplatten vor, um den Assay einzurichten. Fügen Sie 20 Mikroliter einzelner Phagen oder Phagencocktails zu den Vertiefungen eins bis acht der obersten Reihe A der Mikroplatte hinzu.
Für eine phagenfreie und blanko-Kontrolle fügen Sie 20 Mikroliter mTSB in die obere Vertiefung der Spalten neun bis 12 hinzu. Mischen Sie während des Pipettierens den Brunneninhalt mit sanfter und wiederholter Aspiration mindestens fünfmal und wechseln Sie die Spitzen zwischen den Verdünnungen. Entfernen Sie 20 Mikroliter aus der letzten Reihe H und richten Sie dann ein Reservoir für den getesteten Bakterienstamm ein, indem Sie zwei bis drei Milliliter der verdünnten Kultur mit einer Ein-Milliliter-Pipette in das Reservoir übertragen.
Fügen Sie mit einer Mehrkanalpipette 20 Mikroliter der verdünnten Bakterienkultur zu jeder Vertiefung in den Spalten eins bis 10 hinzu, während Sie die Spitzen zwischen den einzelnen Zugaben wechseln. Abdecken und inkubieren Sie die Mikrotiterplatte bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie im Abstand von zwei Stunden die Mikrotiterplatte aus dem Inkubator und lesen Sie die Platte mit einem Mikrotiterplattenleser ab.
Alternativ können Sie die Platte in einem Mikrotiterplattenleser inkubieren und im Laufe der Zeit lesen. Um die optische Dichte bei 600 Nanometern mit einem Mikrotiterplattenleser zu untersuchen, öffnen Sie das Programm auf einem Mikrotiterplattenleser. Wählen Sie im Fenster Mit den Startoptionen den einfachen Modus aus, und wählen Sie dann im Task-Manager neues Protokoll erstellen aus.
Wählen Sie im Fenster Plattentyp auswählen die Option 96-Well-Platte aus der Dropdown-Liste aus. Wählen Sie als Erkennungsmethode Absorption als Lesetyp aus, wählen Sie die Option Endpunkt/Kinetik für optiktyp aus, wählen Sie Monochromatoren aus, und klicken Sie dann auf OK. Geben Sie für Leseschritt 600 Nanometer für Wellenlängen ein, wählen Sie Normal für die Lesegeschwindigkeit und klicken Sie auf OK.To die Temperatur für den Assay einzustellen, klicken Sie auf das Kontrollkästchen Inkubieren und wählen Sie Inkubator Ein.Geben Sie die gewünschte Temperatur in das Temperaturfeld ein und klicken Sie dann auf OK. Klicken Sie auf das Kontrollkästchen Vorheizen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren für die Inkubationstemperatur von 37 Grad Celsius, obwohl die Option für die Testbedingungen bei 22 Grad Celsius nicht erforderlich ist. Um die Kondensation auf dem Plattendeckel während der Inkubation zu verhindern, legen Sie den Temperaturgradienten fest, indem Sie einen Wert in das Feld Verlauf eingeben und dann auf OK klicken. Klicken Sie anschließend auf das Kontrollkästchen Kinetik, um das kinetische Setup zu öffnen.
Stellen Sie die Laufzeit auf 10 Stunden für 37 Grad Celsius Inkubation oder 22 Stunden für Raumtemperatur ein und geben Sie zwei Stunden als Leseintervall ein, dann klicken Sie auf OK. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Schütteln im Verfahrensfenster, um die Schüttelbedingung einzurichten, falls erforderlich für jeden kinetischen Lesevorgang. Wählen Sie Linear als Shake-Modus und ändern Sie die Dauer auf 30 Sekunden. Legen Sie den Wert für die lineare Frequenz auf 731 Zyklen pro Minute fest und klicken Sie dann im Dialogfenster Protokollzusammenfassung auf OK.In, klicken Sie auf Plattenlayout, wählen Sie Leerzeichen, Assay-Steuerelemente und Proben aus und klicken Sie auf Weiter.
Nachdem Sie die Einstellungen für jeden Well-Typ definiert haben, klicken Sie auf Fertig stellen. Wählen Sie in der linken Benutzeroberfläche eine Well-ID aus, weisen Sie sie der matrix zu, die im Fenster Plattenlayout angezeigt wird, und klicken Sie dann auf OK. Klicken Sie auf die Schaltfläche Read Plate, speichern Sie das Protokoll als prt-Datei und klicken Sie auf Speichern. Legen Sie die Platte ein und klicken Sie auf OK. Sobald das Experiment abgeschlossen ist, speichern Sie das Experiment als xpt-Datei und klicken Sie auf Speichern.
Exportieren Sie die Daten nach Excel, indem Sie zur weiteren Analyse im Meldungsfenster auf die Schaltfläche Ja klicken. Klicken Sie auf die Option Ja/Nein speichern und das Kontrollkästchen Nicht erneut fragen, um die Einstellung zu speichern. Im Anschluss an das Protokoll wurde ein Vergleich der Phagenwirksamkeit mit verschiedenen Phagenkombinationen, Temperaturen, Zeiten und der Vielzahl von Infektionen oder MOIs durchgeführt.
Basierend auf dieser Analyse wurde die Anti-O157-Phagenwirksamkeit nach 14, 16 oder 18 Stunden Inkubation bei 22 Grad Celsius maximiert. Um die Phagenabtötungskinetik von Bakterien zu verstehen, wurden OD-Werte bei 600 Nanometern gegen Probenahmezeit, MOIs und Phagenbehandlung aufgetragen. Dargestellt sind die repräsentativen Bakterienwachstumskurven bei 37 Grad Celsius behandelt.
T4 hemmte das Bakterienwachstum bei jeder Probenahme vollständig, selbst bei niedrigem MOI. Um das phagenhemmende Bakterienwachstum zu analysieren, wurden die mittleren OD-Werte aller MOIs gegen jede Probenahmezeit und Phagenbehandlung aufgetragen. Die repräsentativen Grafiken bei zwei Temperaturen zeigten, dass die Wirksamkeit der Phagenabtötung, beispielsweise für T1 plus T4, bei 22 Grad Celsius im Vergleich zu 37 Grad Celsius erhöht war.
Der Vergleich der Gesamtpphagenwirksamkeit wird gezeigt, was die Identifizierung der besten Phasenbehandlung erleichtert. Zum Beispiel war für den Escherichia coli-Stamm 3081 die Behandlung mit den Phagen T4 und T5 plus T4 bei 37 Grad Celsius die wirksamste Behandlung. Bei 22 Grad Celsius waren jedoch zusätzlich zu T4 Phagen T1 plus T4, T1 plus T4 plus rV5 und vier Phagencocktails wirksam.
Bei der Durchführung dieses Verfahrens sind ein äußerst genaues Pipettieren, insbesondere bei Verwendung einer Mehrkanalpipette, und eine einheitliche Herangehensweise unerlässlich, um vergleichbare und interpretierbare Ergebnisse zu erhalten. Folgeexperimente sind erforderlich, um die weitere Leistung des einflussreichsten Cocktails im Screening zu bewerten und das Auftreten von Antiphagenmutanten in einem ausgedehnten Brühenkultursystem und anderen biologischen Matrices zu verhindern.
