Este protocolo de fácil execução avalia a eficácia antibacteriana de diversas combinações de bacteriófago, também conhecidos como coquetéis phage, em condições variadas em um ambiente de alta produtividade. As principais vantagens da técnica são a capacidade de transmitir diferentes fatores bióticos e abióticos, como a temperatura, que podem afetar a eficácia da praga sob uma série de condições ambientais. Este método pode facilitar o design de coquetéis phage apropriados para melhorar o biocontrole e os desfechos terapêuticos e determinar a interação entre hospedeiros bacterianos e bacteriófagos.
Para começar, configure o ensaio de microplacão usando pontas filtradas para evitar contaminação cruzada. Primeiro, adicione 180 microliters de mTSB nos poços das colunas de um a 12 da microplaca de 96 poços, depois prepare diluições em série dez vezes de cada phage em colunas de um a oito dos microplacas estéreis de 96 poços para configurar o ensaio. Adicione 20 microliters de phages individuais ou coquetéis de phage a poços de um a oito da linha superior A da microplacão.
Para controle em branco e sem phage, adicione 20 microliters de mTSB ao poço superior das colunas de nove a 12. Ao pipetar, misture o conteúdo do poço com aspiração suave e repetida pelo menos cinco vezes e mudando as pontas entre as diluições. Remova 20 microliters da última linha H, em seguida, configure um reservatório para a cepa bacteriana testada transferindo dois a três mililitros da cultura diluída para o reservatório usando uma pipeta de um mililitro.
Usando uma pipeta multicanal, adicione 20 microliters da cultura bacteriana diluída a cada poço em colunas de um a 10 enquanto muda dicas entre cada adição. Cubra e incubar a microplacão a 37 graus Celsius. Em intervalos de duas horas, remova a microplaca da incubadora e leia a placa usando um leitor de microplaca.
Alternativamente, incubar a placa em um leitor de microplatos e lê-la ao longo do tempo. Para examinar a densidade óptica em 600 nanômetros usando um leitor de microplacândia, abra o programa em um leitor de microplatos. Selecione o Modo Simples na janela de opções de inicialização e selecione Criar um novo protocolo no gerenciador de tarefas.
Na janela Selecionar placa tipo, escolha placa de 96 poços na lista suspensa. Como método de detecção, selecione Absorver para o tipo de leitura, selecione a opção Endpoint/Kinetic para tipo de óptica, selecione Monocromadores e clique em OK. Para Read Step, digite 600 nanômetros para comprimentos de onda, selecione Normal para a velocidade de leitura e clique em OK.To definir a temperatura do ensaio, clique na caixa de seleção Incubate e selecione Incubadora On.Digite a temperatura desejada na caixa de temperatura e clique em OK. Clique no Pré-aqueça antes de continuar com a próxima caixa de seleção de passos para a temperatura de incubação de 37 graus Celsius, embora a opção não seja necessária para as condições de teste a 22 graus Celsius. Para evitar a condensação na tampa da placa durante a incubação, defina o gradiente de temperatura digitando um valor na caixa de gradiente e clique em OK. Em seguida, clique na caixa de seleção Cinética para abrir a configuração cinética.
Defina o Tempo de execução por 10 horas para incubação de 37 graus Celsius ou 22 horas para temperatura ambiente e digite duas horas como o intervalo de leitura, em seguida, clique em OK. Clique na caixa de seleção Shake na janela do procedimento para configurar a condição de shake, se necessário para cada leitura cinética. Selecione Linear como Modo Shake e altere a duração para 30 segundos. Defina o valor da frequência linear para 731 ciclos por minuto e, em seguida, clique em OK.In janela de diálogo resumo do protocolo, clique em Layout da placa, selecione Espaços em Branco, Controles de Ensaio e Amostras e clique em Seguir.
Depois de definir as configurações para cada tipo de poço, clique em Concluir. Selecione um ID de poço na interface lateral esquerda, atribua-o à matriz mostrada na janela Layout da placa e clique em OK. Clique no botão Ler placa, salve o protocolo como um arquivo prt e clique em Salvar. Insira a placa e clique em OK. Uma vez que o experimento seja concluído, salve o experimento como um arquivo xpt e clique em Salvar.
Exporte os dados para o Excel clicando no botão Sim na caixa de janela de mensagens para análise posterior. Clique na seleção Salvar Sim/Não e não peça novamente a caixa de seleção para salvar a preferência. Seguindo o protocolo, foi realizada uma comparação da eficácia da praga com várias combinações de phage, temperaturas, tempos e multiplicidade de infecções, ou MEIs.
Com base nesta análise, a eficácia da praga anti-O157 foi maximizada após 14, 16 ou 18 horas de incubação a 22 graus Celsius. Para a compreensão da cinética de matança de bactérias, os valores de OD em 600 nanômetros foram traçados contra o tempo de amostragem, MOIs e tratamento de phage. As curvas representativas de crescimento bacteriano a 37 graus Celsius tratadas são mostradas.
T4 inibiu completamente o crescimento bacteriano a cada tempo de amostragem, mesmo em moi baixo. Para analisar o crescimento bacteriano inibido da praga, os valores médios de OD de todos os MEIs foram plotados em cada tempo de amostragem e tratamento de phage. Os gráficos representativos a duas temperaturas revelaram que a eficácia da morte por phage, por exemplo, para T1 mais T4 foi aumentada a 22 graus Celsius em comparação com 37 graus Celsius.
Mostra-se a comparação da eficácia geral da phage, o que facilita a identificação do melhor tratamento de fase. Por exemplo, para escherichia coli cepa 3081, o tratamento com phages T4 e T5 plus T4 foi o tratamento mais eficaz em 37 graus Celsius. No entanto, a 22 graus Celsius, além do T4, phage T1 plus T4, T1 plus T4 plus rV5, e quatro coquetéis phage foram eficazes.
Ao realizar este procedimento, a pipetação extremamente precisa, particularmente quando se utiliza uma pipeta multicanal e a uniformidade da abordagem são essenciais para obter resultados comparáveis e interpretatáveis. Experimentos de acompanhamento são necessários para avaliar o desempenho do coquetel mais influente na triagem, impedindo o surgimento de mutantes antifago em um extenso sistema de cultura de caldo e outras matrizes biológicas.
