פרוטוקול קל לביצוע זה מעריך את היעילות האנטיבקטריאלית של שילובי בקטריופאג 'מגוונים, הידועים גם בשם קוקטיילים פאג ', בתנאים משתנים בסביבה בעלת תפוקה גבוהה. היתרונות העיקריים של הטכניקה הם היכולת להזרים ביוטיקה שונה וגורמים אביוטיים, כגון טמפרטורה, שעשויים להשפיע על יעילות הפאג ' תחת מגוון של תנאים סביבתיים. שיטה זו יכולה להקל על העיצוב של קוקטיילים פאג 'מתאים כדי לשפר את התוצאות biocontrol וטיפול ולקבוע את האינטראקציה בין מארחים חיידקים ובקטריופאג'ים.
ראשית, הגדר את בדיקות המיקרו-לוח באמצעות טיפים מסוננים כדי למנוע זיהום צולב. ראשית, להוסיף 180 microliters של mTSB בבארות של עמודות אחד עד 12 של 96-well microplate, ולאחר מכן להכין דילול טורי פי עשרה של כל פאג בעמודות אחד עד שמונה של microplates סטרילי 96-well כדי להגדיר את ה- assay. הוסיפו 20 מיקרוליטרים של פאג'ים בודדים או קוקטיילים פאג' לבארות אחת עד שמונה מהשורה העליונה A של המיקרו-לוח.
לשליטה נטולת פאג' וריק, הוסף 20 מיקרוליטרים של mTSB לבאר העליונה של עמודות תשע עד 12. תוך כדי צנרת, מערבבים את תכולת הבאר עם שאיפה עדינה וחזור על עצמה לפחות חמש פעמים ושינוי טיפים בין דילול. הסר 20 מיקרוליטרים מהשורה האחרונה H, ולאחר מכן הקים מאגר לזן החיידקי שנבדק על ידי העברת שניים עד שלושה מיליליטר של התרבות מדוללת למאגר באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד.
באמצעות פיפטה רב ערוצית, הוסף 20 מיקרוליטרים של תרבית החיידקים מדוללת לכל באר בעמודות 1 עד 10 תוך שינוי טיפים בין כל תוספת. מכסים ודגרת את המיקרו-לוח ב-37 מעלות צלזיוס. במרווחי זמן של שעתיים, הסירו את המיקרו-פלט מהאינקובטור וקראו את הלוח באמצעות קורא מיקרו-לוחית.
לחלופין, לדגור על הצלחת בקורא מיקרו-לוחיות ולקרוא אותה לאורך זמן. כדי לבחון את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-לוח, פתח את התוכנית על קורא מיקרו-לוח. בחר במצב פשוט בחלון אפשרויות האתחול ולאחר מכן בחר צור פרוטוקול חדש במנהל המשימות.
מהחלון בחר סוג לוחית, בחר לוחית 96-well מהרשימה הנפתחת. כשיטת זיהוי, בחר Absorbance עבור סוג הקריאה, בחר באפשרות נקודת קצה/קינטית עבור סוג אופטיקה, בחר מונוכרומאטורים ולאחר מכן לחץ על אישור. עבור קרא שלב, הזן 600 ננומטר עבור אורכי גל, בחר רגיל למהירות קריאה ולחץ OK.To להגדיר את הטמפרטורה עבור הבדיקה, לחץ על תיבת הסימון דגירה ובחר חממה On.Enter את הטמפרטורה הרצויה בתיבת הטמפרטורה ולאחר מכן לחץ על אישור. לחץ על תיבת הסימון מחממים מראש לפני שתמשיך עם השלב הבא לטמפרטורת הדגירה של 37 מעלות צלזיוס, אם כי האפשרות אינה נדרשת לתנאי הבדיקה ב 22 מעלות צלזיוס. כדי למנוע את העיבוי במכסה הצלחת במהלך הדגירה, הגדר את מעבר הצבע של הטמפרטורה על-ידי הזנת ערך בתיבה מעבר הצבע ולאחר מכן לחץ על אישור. לאחר מכן, לחץ על תיבת הסימון קינטית כדי לפתוח את ההתקנה הקינטית.
הגדר את זמן הריצה במשך 10 שעות עבור דגירה של 37 מעלות צלזיוס או 22 שעות לטמפרטורת החדר והזן שעתיים כמרווח הקריאה, ולאחר מכן לחץ על אישור. לחץ על תיבת הסימון שייק בחלון הפרוצדורה כדי להגדיר את מצב השייק, במידת הצורך עבור כל קריאה קינטית. בחרו 'ליניארי כמצב שייק' ושנו את משך הזמן ל-30 שניות. הגדר ערך תדירות ליניארית ל- 731 מחזורים לדקה ולאחר מכן לחץ על OK.In חלון דו-שיח של סיכום פרוטוקול, לחץ על פריסת לוח, בחר ריקים, פקדי צ'ייד ודוגמאות ולחץ על הבא.
לאחר הגדרת ההגדרות עבור כל סוג באר, לחץ על סיום. בחר מזהה באר בממשק בצד שמאל, הקצה אותו למטריצה המוצגת בחלון פריסת לוח ולאחר מכן לחץ על אישור. לחץ על לחצן קרא לוחית, שמור את הפרוטוקול כקובץ prt ולחץ על שמור. הכנס את הצלחת ולחץ על אישור. לאחר השלמת הניסוי, שמור את הניסוי כקובץ xpt ולחץ על שמור.
יצא את הנתונים ל- Excel על-ידי לחיצה על לחצן כן בתיבה חלון ההודעה לניתוח נוסף. לחץ על הבחירה שמור כן/לא ותיבת הסימון אל תבקש שוב לשמור העדפה. בעקבות הפרוטוקול, בוצעה השוואה של יעילות פאג' עם שילובי פאג'ים שונים, טמפרטורות, זמנים וריבוי זיהומים, או MOIs.
בהתבסס על ניתוח זה, יעילות פאג' נגד O157 הוגדלה לאחר 14, 16 או 18 שעות של דגירה ב 22 מעלות צלזיוס. להבנת הפאג' הורג קינטיקה של חיידקים, ערכי OD ב 600 ננומטר זוו נגד זמן דגימה, MOIs, וטיפול phage. עקומות הצמיחה החיידקיות הייצוגיות ב 37 מעלות צלזיוס מטופלים מוצגים.
T4 עיכב לחלוטין את צמיחת החיידקים בכל זמן דגימה אפילו ב- MOI נמוך. כדי לנתח את צמיחת החיידקים המעכבת פאג ', ערכי OD הממוצעים מכל MOIs היו שרטטו נגד כל זמן דגימה וטיפול פאג '. הגרפים הייצוגיים בשתי טמפרטורות גילו כי יעילות ההרג של פאג', למשל, עבור T1 פלוס T4 שופרה ב-22 מעלות צלזיוס לעומת 37 מעלות צלזיוס.
ההשוואה של יעילות הפאג' הכוללת מוצגת, המאפשרת זיהוי הטיפול בשלב הטוב ביותר. לדוגמה, עבור זן Escherichia coli 3081, טיפול עם פאג'ים T4 ו- T5 פלוס T4 היה הטיפול היעיל ביותר ב 37 מעלות צלזיוס. עם זאת, ב 22 מעלות צלזיוס, בנוסף T4, פאג T1 בתוספת T4, T1 בתוספת T4 בתוספת rV5, וארבעה קוקטיילים פאג 'היו יעילים.
בעת ביצוע הליך זה, pipetting מדויק מאוד, במיוחד בעת שימוש pipette רב ערוצי ואחידות הגישה חיוניים כדי להשיג תוצאות דומות ופריש. ניסויי מעקב נדרשים כדי להעריך את הביצועים הנוספים של הקוקטייל המשפיע ביותר בהקרנה, ולמנוע את הופעתם של מוטציות אנטיפג 'במערכת תרבות מרק נרחבת ומטריצות ביולוגיות אחרות.
