Ce protocole facile à réaliser évalue l’efficacité antibactérienne de diverses combinaisons de bactériophages, également connues sous le nom de cocktails de phages, dans des conditions variables dans un environnement à haut débit. Les principaux avantages de la technique sont la capacité de diffuser différents facteurs biotiques et abiotiques, tels que la température, qui peuvent affecter l’efficacité des phages dans diverses conditions environnementales. Cette méthode peut faciliter la conception de cocktails de phages appropriés pour améliorer le biocontrôle et les résultats thérapeutiques et déterminer l’interaction entre les hôtes bactériens et les bactériophages.
Pour commencer, configurez le test sur microplaque à l’aide d’embouts filtrés pour éviter la contamination croisée. Tout d’abord, ajoutez 180 microlitres de mTSB dans les puits des colonnes un à 12 de la microplaque de 96 puits, puis préparez des dilutions décuplées en série de chaque phage dans les colonnes un à huit des microplaques stériles de 96 puits pour mettre en place le test. Ajouter 20 microlitres de phages individuels ou de cocktails de phages aux puits un à huit de la rangée supérieure A de la microplaque.
Pour un contrôle sans phages et à blanc, ajoutez 20 microlitres de mTSB au puits supérieur des colonnes neuf à 12. Pendant le pipetage, mélanger le contenu du puits avec une aspiration douce et répétée au moins cinq fois et en changeant les extrémités entre les dilutions. Retirez 20 microlitres de la dernière rangée H, puis installez un réservoir pour la souche bactérienne testée en transférant deux à trois millilitres de la culture diluée dans le réservoir à l’aide d’une pipette d’un millilitre.
À l’aide d’une pipette multicanal, ajouter 20 microlitres de la culture bactérienne diluée à chaque puits dans les colonnes un à 10 tout en changeant les embouts entre chaque ajout. Couvrir et incuber la microplaque à 37 degrés Celsius. À deux heures d’intervalle, retirez la microplaque de l’incubateur et lisez la plaque à l’aide d’un lecteur de microplaques.
Alternativement, incubez la plaque dans un lecteur de microplaques et lisez-la au fil du temps. Pour examiner la densité optique à 600 nanomètres à l’aide d’un lecteur de microplaques, ouvrez le programme sur un lecteur de microplaques. Sélectionnez le mode simple dans la fenêtre des options de démarrage, puis sélectionnez Créer un nouveau protocole dans le Gestionnaire des tâches.
Dans la fenêtre Sélectionner le type de plaque, choisissez plaque à 96 puits dans la liste déroulante. Comme méthode de détection, sélectionnez Absorbance pour le type de lecture, sélectionnez l’option Point de terminaison/Cinétique pour le type optique, sélectionnez Monochromateurs, puis cliquez sur OK. Pour l’étape de lecture, entrez 600 nanomètres pour les longueurs d’onde, sélectionnez Normal pour la vitesse de lecture et cliquez sur OK.To réglez la température pour le test, cliquez sur la case à cocher Incuber et sélectionnez Incubateur activé.Entrez la température souhaitée dans la zone température, puis cliquez sur OK. Cliquez sur la case à cocher Préchauffer avant de passer à l’étape suivante pour la température d’incubation de 37 degrés Celsius, bien que l’option ne soit pas requise pour les conditions de test à 22 degrés Celsius. Pour éviter la condensation sur le couvercle de la plaque pendant l’incubation, définissez le gradient de température en entrant une valeur dans la zone de dégradé, puis cliquez sur OK. Ensuite, cliquez sur la case à cocher Cinétique pour ouvrir la configuration cinétique.
Réglez la durée d’exécution pendant 10 heures pour une incubation de 37 degrés Celsius ou 22 heures pour la température ambiante et entrez deux heures comme intervalle de lecture, puis cliquez sur OK. Cliquez sur la case à cocher Secouer dans la fenêtre de procédure pour configurer la condition de secousse, si nécessaire pour chaque lecture cinétique. Sélectionnez Linéaire comme mode de secousse et modifiez la durée à 30 secondes. Définissez la valeur fréquence linéaire sur 731 cycles par minute, puis cliquez sur OK.In la fenêtre Dialogue de résumé du protocole, cliquez sur Disposition de la plaque, sélectionnez Blancs, Contrôles de test et Échantillons, puis cliquez sur Suivant.
Après avoir défini les paramètres pour chaque type de puits, cliquez sur Terminer. Sélectionnez un ID de puits dans l’interface de gauche, affectez-le à la matrice affichée dans la fenêtre Disposition des plaques, puis cliquez sur OK. Cliquez sur le bouton Lire la plaque, enregistrez le protocole en tant que fichier prt et cliquez sur Enregistrer. Insérez la plaque et cliquez sur OK. Une fois l’expérience terminée, enregistrez l’expérience en tant que fichier xpt et cliquez sur Enregistrer.
Exportez les données vers Excel en cliquant sur le bouton Oui dans la fenêtre de message pour une analyse plus approfondie. Cliquez sur la sélection Enregistrer Oui/Non et cochez la case Ne plus demander pour enregistrer la préférence. À la suite du protocole, une comparaison de l’efficacité des phages avec diverses combinaisons de phages, températures, temps et multiplicité d’infections, ou ME, a été effectuée.
Sur la base de cette analyse, l’efficacité des phages anti-O157 a été maximisée après 14, 16 ou 18 heures d’incubation à 22 degrés Celsius. Pour comprendre la cinétique de destruction des phages des bactéries, les valeurs de DO à 600 nanomètres ont été tracées en fonction du temps d’échantillonnage, des MEI et du traitement des phages. Les courbes de croissance bactérienne représentatives à 37 degrés Celsius traitées sont montrées.
T4 a complètement inhibé la croissance bactérienne à chaque moment d’échantillonnage, même à faible MOI. Pour analyser la croissance bactérienne inhibée par les phages, les valeurs moyennes de DO de tous les MOO ont été tracées par rapport à chaque temps d’échantillonnage et à chaque traitement des phages. Les graphiques représentatifs à deux températures ont révélé que l’efficacité de la destruction des phages, par exemple, pour T1 plus T4 était améliorée à 22 degrés Celsius contre 37 degrés Celsius.
La comparaison de l’efficacité globale des phages est montrée, ce qui facilite l’identification du meilleur traitement de phase. Par exemple, pour la souche 3081 d’Escherichia coli, le traitement par phages T4 et T5 plus T4 a été le traitement le plus efficace à 37 degrés Celsius. Cependant, à 22 degrés Celsius, en plus de T4, les phages T1 plus T4, T1 plus T4 plus rV5 et quatre cocktails de phages ont été efficaces.
Lors de l’exécution de cette procédure, un pipetage extrêmement précis, en particulier lors de l’utilisation d’une pipette multicanal et l’uniformité de l’approche sont essentiels pour obtenir des résultats comparables et interprétables. Des expériences de suivi sont nécessaires pour évaluer les performances ultérieures du cocktail le plus influent dans le dépistage, empêchant l’émergence de mutants antiphages dans un vaste système de culture de bouillon et d’autres matrices biologiques.
