Este protocolo fácil de realizar evalúa la eficacia antibacteriana de diversas combinaciones de bacteriófagos, también conocidas como cócteles de fagos, en condiciones variables en un entorno de alto rendimiento. Las principales ventajas de la técnica es la capacidad de transmitir diferentes bióticos y factores abióticos, como la temperatura, que pueden afectar la eficacia de los fagos en una variedad de condiciones ambientales. Este método puede facilitar el diseño de cócteles de fagos apropiados para mejorar el biocontrol y los resultados terapéuticos y determinar la interacción entre los huéspedes bacterianos y los bacteriófagos.
Para empezar, configure el ensayo de microplacas utilizando puntas filtradas para evitar la contaminación cruzada. Primero, agregue 180 microlitros de mTSB en los pozos de las columnas uno a 12 de la microplaca de 96 pocillos, luego prepare diluciones de diez veces en serie de cada fago en columnas de una a ocho de las microplacas estériles de 96 pocillos para configurar el ensayo. Agregue 20 microlitros de fagos individuales o cócteles de fagos a los pocillos del uno al ocho de la fila superior A de la microplaca.
Para un control sin fagos y en blanco, agregue 20 microlitros de mTSB al pozo superior de las columnas nueve a 12. Mientras pipetea, mezcle el contenido del pozo con una aspiración suave y repetida al menos cinco veces y cambie las puntas entre diluciones. Retire 20 microlitros de la última fila H, luego configure un reservorio para la cepa bacteriana probada transfiriendo de dos a tres mililitros del cultivo diluido al reservorio usando una pipeta de un mililitro.
Usando una pipeta multicanal, agregue 20 microlitros del cultivo bacteriano diluido a cada pozo en columnas del uno al 10 mientras cambia las puntas entre cada adición. Cubra e incube la microplaca a 37 grados centígrados. A intervalos de dos horas, retire la microplaca de la incubadora y lea la placa con un lector de microplacas.
Alternativamente, incube la placa en un lector de microplacas y léala con el tiempo. Para examinar la densidad óptica a 600 nanómetros utilizando un lector de microplacas, abra el programa en un lector de microplacas. Seleccione el Modo simple en la ventana de opciones de inicio y, a continuación, seleccione Crear un nuevo protocolo en el Administrador de tareas.
En la ventana Seleccionar tipo de placa, elija placa de 96 pocillos en la lista desplegable. Como método de detección, seleccione Absorbancia para el tipo de lectura, seleccione La opción Extremo/cinética para el tipo de óptica, seleccione Monocromadores y, a continuación, haga clic en Aceptar. En Read Step (Paso de lectura), ingrese 600 nanómetros para longitudes de onda, seleccione Normal para la velocidad de lectura y haga clic en OK.To establecer la temperatura para el ensayo, haga clic en la casilla de verificación Incubar y seleccione Incubadora encendida.Ingrese la temperatura deseada en el cuadro de temperatura y luego haga clic en Aceptar. Haga clic en la casilla Precalentar antes de continuar con el siguiente paso para la temperatura de incubación de 37 grados Centígrados, aunque la opción no es necesaria para las condiciones de prueba a 22 grados Centígrados. Para evitar la condensación en la tapa de la placa durante la incubación, establezca el gradiente de temperatura introduciendo un valor en el cuadro de degradado y, a continuación, haga clic en Aceptar. A continuación, haga clic en la casilla de verificación Cinética para abrir la configuración cinética.
Establezca el tiempo de ejecución durante 10 horas para la incubación de 37 grados Celsius o 22 horas para la temperatura ambiente e ingrese dos horas como intervalo de lectura, luego haga clic en Aceptar. Haga clic en la casilla de verificación Agitar en la ventana de procedimiento para configurar la condición de agitación, si es necesario para cada lectura cinética. Seleccione Lineal como Modo de agitación y cambie la Duración a 30 segundos. Establezca el valor de frecuencia lineal en 731 ciclos por minuto y, a continuación, haga clic en OK.In la ventana Diálogo de resumen de protocolo, haga clic en Diseño de placa, seleccione Espacios en blanco, Controles de ensayo y Muestras, y haga clic en Siguiente.
Después de definir la configuración para cada tipo de pozo, haga clic en Finalizar. Seleccione un ID de pozo en la interfaz del lado izquierdo, asígnelo a la matriz que se muestra en la ventana Diseño de placas y, a continuación, haga clic en Aceptar. Haga clic en el botón Leer placa, guarde el protocolo como un archivo prt y haga clic en Guardar. Inserte la placa y haga clic en Aceptar. Una vez completado el experimento, guarde el experimento como un archivo xpt y haga clic en Guardar.
Exporte los datos a Excel haciendo clic en el botón Sí en el cuadro de la ventana de mensaje para un análisis más detallado. Haga clic en la selección Guardar sí /no y la casilla de verificación No volver a preguntar para guardar la preferencia. Siguiendo el protocolo, se realizó una comparación de la eficacia de los fagos con varias combinaciones de fagos, temperaturas, tiempos y multiplicidad de infecciones, o MOI.
Sobre la base de este análisis, la eficacia de los fagos anti-O157 se maximizó después de 14, 16 o 18 horas de incubación a 22 grados centígrados. Para comprender la cinética de eliminación de fagos de las bacterias, los valores de OD a 600 nanómetros se trazaron contra el tiempo de muestreo, los MOI y el tratamiento con fagos. Se muestran las curvas de crecimiento bacteriano representativas a 37 grados centígrados tratados.
T4 inhibió completamente el crecimiento bacteriano en cada momento de muestreo, incluso a bajo MOI. Para analizar el crecimiento bacteriano inhibido por fagos, se trazaron los valores medios de OD de todos los MOI contra cada tiempo de muestreo y tratamiento con fagos. Los gráficos representativos a dos temperaturas revelaron que la eficacia de la matanza de fagos, por ejemplo, para T1 más T4 se mejoró a 22 grados Celsius en comparación con 37 grados Celsius.
Se muestra la comparación de la efectividad general de los fagos, lo que facilita la identificación de la mejor fase de tratamiento. Por ejemplo, para escherichia coli cepa 3081, el tratamiento con fagos T4 y T5 más T4 fue el tratamiento más efectivo a 37 grados centígrados. Sin embargo, a 22 grados Centígrados, además de T4, los fagos T1 más T4, T1 más T4 más rV5 y cuatro cócteles de fagos fueron efectivos.
Al realizar este procedimiento, el pipeteo extremadamente preciso, particularmente cuando se utiliza una pipeta multicanal y la uniformidad del enfoque son esenciales para obtener resultados comparables e interpretables. Se requieren experimentos de seguimiento para evaluar el rendimiento posterior del cóctel más influyente en el cribado, previniendo la aparición de mutantes antífagos en un extenso sistema de cultivo de caldo y otras matrices biológicas.
