このプロトコルを実行しやすいプロトコルは、ハイスループット設定で様々な条件下で、ファージカクテルとしても知られている多様なバクテリオファージの組み合わせの抗菌効果を評価します。この技術の主な利点は、さまざまな環境条件下でファージの有効性に影響を与える可能性のある、異なるバイオティクスおよび不生物因子(温度など)を流す能力です。この方法は、適切なファージカクテルの設計を促進し、バイオコントロールおよび治療結果を強化し、細菌宿主とバクテリオファージとの相互作用を決定することができる。
まず、クロス汚染を避けるために、フィルター処理されたチップを使用してマイクロプレートアッセイを設定します。まず、96ウェルマイクロプレートの1~12個の列のウェルに180マイクロリットルのmTSBを加え、滅菌96ウェルマイクロプレートの1~8列に各ファージの連続10倍希釈を調製してアッセイを設定します。マイクロプレートの一番上の行Aの1〜8の井戸に個々のファージまたはファージカクテルの20マイクロリットルを追加します。
ファージフリーおよびブランク制御の場合、カラム9から12の上部ウェルに20マイクロリットルのmTSBを加えます。ピペットしながら、少なくとも5回は穏やかで繰り返し吸引し、希釈間の先端を変更して井戸の内容物を混ぜます。最後の行Hから20マイクロリットルを取り除き、1ミリリットルのピペットを使用して希釈培養物の2〜3ミリリットルをリザーバに移すことによって、試験された細菌株の貯蔵所を設置する。
マルチチャネルピペットを使用して、希釈された細菌培養物の20マイクロリットルを列1〜10の各ウェルに加え、各添加の間に先端を変更します。マイクロプレートを37°Cで覆い、インキュベートします。2時間間隔で、インキュベーターからマイクロプレートを取り出し、マイクロプレートリーダーを使用してプレートを読み取ります。
あるいは、マイクロプレートリーダーにプレートをインキュベートし、時間をかけて読み取ります。マイクロプレートリーダーを用いて600ナノメートルの光密度を調べるには、マイクロプレートリーダーでプログラムを開きます。スタートアップ オプション ウィンドウで簡易モードを選択し、タスク マネージャで新しいプロトコルを作成を選択します。
[プレートタイプの選択]ウィンドウから、ドロップダウン リストから 96 ウェル プレートを選択します。検出方法として、読み取りタイプに対して[吸光度]を選択し、光学タイプに対して[エンドポイント/キネティック]オプションを選択し、[モノクロータ]を選択して、[OK]をクリックします。[読み取りステップ]に波長として600ナノメートルを入力し、読み取り速度として[標準]を選択し、アッセイの温度を設定 OK.To、[インキュベート]チェックボックスをオンにして、[インキュベーターオン]を選択します。摂氏22度の試験条件にはオプションは必要ありませんが、摂氏37度のインキュベーション温度の次のステップに進む前に[予熱]チェックボックスをクリックします。インキュベーション中にプレート蓋の凝縮を防ぐには、勾配ボックスに値を入力して温度勾配を設定し、[OK]をクリックします。次に、[キネティック]チェックボックスをクリックして、キネティック設定を開きます。
[実行時間] を摂氏 37 度のインキュベーションで 10 時間、室温で 22 時間に設定し、読み取り間隔として 2 時間を入力して、[OK] をクリックします。各運動読み取りに必要な場合は、プロシージャウィンドウの[シェイク]チェックボックスをクリックしてシェイク条件を設定します。[線形]を[シェイク モード]に選択し、[持続時間]を 30 秒に変更します。[リニア周波数]の値を毎分 731 サイクルに設定し、[プロトコルの概要] ダイアログ ウィンドウ OK.In クリックし、[プレート レイアウト] をクリックして、[ブランク]、[アッセイ コントロール]、[サンプル] を選択して、[次へ] をクリックします。
各井戸タイプの設定を定義したら、[完了]をクリックします。左側のインタフェースでウェルIDを選択し、プレートレイアウトウィンドウに表示されるマトリックスに割り当ててからOKをクリックします。[プレートを読み取り]ボタンをクリックし、プロトコルをprtファイルとして保存し、[保存]をクリックします。プレートを挿入し、[OK]をクリックします。実験が完了したら、実験を XPT ファイルとして保存し、[保存] をクリックします。
詳細な分析のために、メッセージ ウィンドウ ボックスの [はい] ボタンをクリックして、データを Excel にエクスポートします。[はい/いいえ]の選択をクリックし、[再び確認しない]チェックボックスをオンにして、設定を保存します。プロトコルに従って、ファージの有効性を様々なファージの組み合わせ、温度、時間、および感染の多重度、またはMOIと比較して行った。
この分析に基づいて、抗O157ファージの有効性は、摂氏22度で14、16、または18時間のインキュベーションの後に最大化された。細菌のファージ殺血動態を理解するために、600ナノメートルのOD値をサンプリング時間、MOI、ファージ治療に対してプロットした。治療した摂氏37度で代表的な細菌増殖曲線を示す。
T4は、低いMOIでも各サンプリング時間で細菌の増殖を完全に阻害した。ファージが細菌増殖を阻害したのを解析するために、全てのMOIからの平均OD値を各サンプリング時間およびファージ処理に対してプロットした。2つの温度の代表的なグラフは、例えば、T1プラスT4のファージ殺薬効が摂氏37度に比べて摂氏22度で強化されたことを明らかにした。
ファージの有効性の全体的な比較が示され、これは最良の段階の処置を特定するのに役立つ。例えば、大腸菌株3081の場合、ファージT4及びT5プラスT4による治療は摂氏37度で最も有効な治療であった。しかし、摂氏22度では、T4に加えて、ファージT1+T4、T1+T4+rV5、4ファージカクテルが有効であった。
この手順を実行する場合、特にマルチチャンネルピペットとアプローチの均一性を使用する場合、極めて正確なピペット化は、同等かつ解釈可能な結果を得るために不可欠である。スクリーニングで最も影響力のあるカクテルのさらなる性能を評価するためにフォローアップ実験が必要であり、広範なスープ培養系および他の生物学的マトリックスにおけるアンティファージ変異体の出現を防ぐ。
