ستساعد هذه الطريقة في توضيح الآليات الجزيئية لظواهر بيولوجية متعددة الأوجه. مثل علم الأحياء الميكانيكي ، والفيزيولوجيا الكهربية البصرية ، وتصوير بروتين الحمض النووي / الحمض النووي الريبي فائق الدقة باستخدام تقنيات التصوير التلقائي للخلايا الحية. يتيح هذا البروتوكول تصحيح تلقائي ومتعدد الوظائف وعالي الإنتاجية والانجراف الذاتي والحصول على الصور على المدى الطويل.
وهو متوافق مع معظم المنصات المجهرية الفلورية ، مثل NYCOM. يجب على أي شخص يجرب هذه التقنية لأول مرة أن يفهم وظيفة كل خطوة ، بدلا من اتباع البروتوكول بدقة فقط ، لضمان نجاح التجربة. ابدأ بوضع غرفة البيئة على المرحلة الآلية للمجهر المقلوب.
اضبط معدل تدفق CO2 على 160 ملليلتر في الدقيقة واضبط درجة حرارة الغرفة. ثم أضف 40 ملليلتر من الماء النقي إلى حمام الغرفة. أخرج طبق بتري ذو القاع الزجاجي مع خلايا من الحاضنة وضعه في غرفة البيئة.
قم بتشغيل وحدة التحكم البؤرية والمجهر المقلوب. قم بتبديل مسار الضوء إلى اليمين. راقب الخلايا المرفقة باستخدام Micro Manager.
إذا تم توصيل خلايا كافية بالجل ، فانقل طبق بتري مرة أخرى إلى الحاضنة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فاستمر في حضانة الخلايا لمدة 30 دقيقة أخرى ل B2B ، و 60 دقيقة لسرطان الرئة أو خلايا PC-9. قطع 2 قطعة صغيرة من الشريط اللاصق ولصقها على الغرفة حول الثقب الدائري.
ثم ضع القليل من الغراء اللاصق على منطقة الشريط التي سيغطيها طبق Petri. أخرج طبق بتري من الحاضنة. ضع طبق بتري ببطء في الغرفة واترك الجزء السفلي من الطبق يتلامس مع الغراء.
اضغط على غطاء طبق بتري لمدة 1 دقيقة للسماح للغراء بالاتصال الكامل مع طبق بتري وتصلبه. ادفع طبق بتري برفق أفقيا للتأكد من أن الغراء قد تصلب وأن طبق بتري لا يتحرك. ثم أغلق غطاء الغرفة.
افتح IntelliJ وقم بتعيين معلمة T1 في السطر 93 من elements_script.java الملف. تأكد من أن هذه القيمة أكبر من وقت تشغيل الماكرو والعناصر المستخدمة للتصوير البؤري لمجال رؤية واحد. انقر فوق الزر "تشغيل" لبدء مشروع AMFIP IntelliJ.
انقر فوق الزر المباشر ومتعدد الاستحواذات على الواجهة الرئيسية ل Micro Manager ، ثم قم بتبديل مسار الضوء للمجهر المقلوب إلى اليمين للتصوير الميداني الساطع. قم بالتبديل إلى الهدف 10 مرات وافتح ضوء LED مع ضبط الكثافة عند 5٪ انقر على هدف مجهر مسار الضوء وزر مصباح LED في لوحة العناصر TI2. اضبط عصا التحكم XY ومقبض الطائرة Z للعثور على الموضع الصحيح ومستوى التركيز البؤري للهلام على طبق Petri.
استخدم هدف 10 مرات للعثور على مجالات الرؤية المناسبة لخلايا مفردة متعددة متصلة بالجل. حدد مربع XY متعدد المواضع في نافذة الاستحواذ متعددة الأبعاد. انقر على زر تحرير قائمة المواقع وراقب نافذة قائمة مواقع المرحلة التي تنبثق.
قم بتغيير الهدف إلى 40 مرة ، وقم بزيادة شدة ضوء LED إلى 15٪ أعد ضبط المرحلة الآلية XY لتحديد مواقع مجالات الرؤية وتسجيل الإحداثيات بالنقر فوق الزر "علامة" في نافذة قائمة موضع المرحلة. سجل من 6 إلى 7 حقول عرض مطلوبة. انقر فوق الزر حفظ باسم في نافذة قائمة موضع المرحلة لتسجيل الإحداثيات وإدخال T1 كقسم الفاصل الزمني للحصول على التصوير إلى T1 في قسم النقطة الزمنية في نافذة الاستحواذ متعددة الأبعاد.
افتح العناصر ، وقم بتغيير مسار الضوء إلى اليمين للتصوير البؤري وأطفئ ضوء LED. ثم انقر فوق الزر "إزالة التعشيق" وقم بتشغيل قناة ليزر FITC لتصوير YAP عن طريق تحديد مربع FITC. بعد ضبط سرعة المسح الضوئي إلى 1 إطار لكل 2 ثانية ، قم بتدوير مقبض المستوى Z للعثور على موضع Z للخلايا المرفقة بسرعة.
سجل الحدود الدنيا والعليا للمكدس Z. انقر فوق الماكرو على الشريط العلوي ، وحدد محرر الماكرو ضمن القائمة المنسدلة الماكرو وأدخل الحدود الدنيا والعليا لمكدس Z في ملف ماكرو. قم بتشغيل قناة ليزر DAPI لتصوير الخرز عن طريق تحديد مربع DAPI للعثور على موضع Z المركز للخرز وتسجيله.
انتقل إلى محرر الماكرو وأدخل القيم المسجلة في ملف الماكرو. لتعيين مهمة تحريك المرحلة الآلية باستخدام AMFIP ، انتقل إلى Micro Manager ، وانقر فوق أتمتة المكونات الإضافية لفتح واجهة المستخدم الرسومية ل AMFIP. ثم انقر فوق إضافة نقطة أو إزالة أزرار النقاط للحصول على العدد الدقيق لحقول العرض المحددة.
أدخل الإحداثيات المسجلة لمجالات الرؤية في لوحة الإحداثيات. حدد إجمالي وقت التجربة في حقل نص إجمالي وقت التجربة. انقر فوق زر تكوين الوقت الإضافي وحدد الفاصل الزمني T2 لنقل المرحلة الآلية إلى كل FOV.
قم بتكبير حجم نافذة العناصر واسحب واجهة المستخدم الرسومية ل AMFIP إلى الجانب الأيمن من الشاشة لتجنب إزعاج واجهة المستخدم الرسومية للعمليات التلقائية للمؤشر ثم انقر فوق الزر إدخال. بعد انتهاء الماكرو الأول. انقر فوق الزر "اكتساب" في نافذة الاستحواذ متعددة الأبعاد.
بعد الانتهاء من التصوير على المدى الطويل ، أوقف مهمة AMFIP بالنقر فوق زر الإيقاف المؤقت في نافذة المكون الإضافي للأتمتة ، وزر الإيقاف في نافذة الاستحواذ متعددة الأبعاد. افتح العناصر واضبط تصوير مكدس Z بالنقر فوق الزرين العلوي والسفلي في نافذة اكتساب ND. قم بتبديل مسار الضوء إلى اليمين وافتح مصباح LED.
قم بإزالة أغطية الغرفة وطبق بتري ببطء وبعناية أثناء مراقبة منظر المجال الساطع لأي انحراف في مجال الرؤية. استخدم ماصة بلاستيكية لامتصاص 0.5 ملليلتر من محلول SDS. امسك الماصة البلاستيكية بعناية فوق وسط الثقافة قليلا في طبق بتري وأضف 1 إلى 2 قطرات من محلول SDS إلى وسط الثقافة.
بمجرد حل الخلايا وعرض المجال الساطع ، أغلق ضوء LED ، وقم بتبديل مسار الضوء إلى اليسار ، وانقر فوق الزر "إزالة التعشيق". قم بتشغيل تصوير مكدس Z واحفظ مكدس الصور كما reference_N، حيث N هو رقم التسلسل لكل مجال عرض. انقر على زر XY متعدد المواضع في نافذة الاستحواذ متعددة الأبعاد.
ثم حدد مجال الرؤية التالي وانقر على زر الانتقال لنقل المرحلة الآلية إلى FOV الثاني. كرر هذه الخطوة لكل مجال عرض. التوطين النووي هو من البروتين المرتبط ب yes أو YAP في B2B ells زاد مع زيادة صلابة الركيزة ، في حين أظهرت خلايا PC-9 تركيز YAP مماثل في النواة والسيتوبلازم على ركائز متفاوتة الصلابة.
زادت الخلية B2B بشكل رتيب من مساحة الانتشار بمرور الوقت ، إلى جانب انخفاض في نسبة YAP النووية إلى السيتوبلازمية ، في حين حافظت خلية PC-9 على منطقة انتشار الخلية غير المتغيرة نسبيا ، والاتجاه ، ونسبة YAP النووية إلى السيتوبلازمية طوال عملية الانتشار لمدة 10 ساعات. خلال مدة 10 ساعات من الانتشار المبكر ، شوهت الخلية B2B التمثيلية بشكل أساسي سطح الركيزة وطبقت الجر الخلوي المتطور زمنيا عبر منطقة الخلية بأكملها. في المقابل ، طورت خلية PC-9 التمثيلية فقط الإزاحة والجر في نهايتين من جسم الخلية ، وتضاءل جرها بعد 7.5 ساعة.
يبدو أن نسبة YAP النووية إلى السيتوبلازمية والجر ثنائي القطب للخلايا B2B تتبعان اتجاهين متميزين ، مما يشير إلى أنه ربما كانت هناك مجموعتان من الخلايا B2B التي تعايشت في التجربة. في المجموعة الأولى ، زادت نسبة YAP النووية إلى السيتوبلازمية والجر ثنائي القطب جنبا إلى جنب مع توسيع منطقة انتشار الخلايا ووصلت إلى الحد الأقصى عند حوالي 1000 ميكرومتر مربع. في المجموعة الثانية ، زادت نسبة YAP النووية إلى السيتوبلازمية والجر ثنائي القطب بمعدل أبطأ مع توسيع منطقة انتشار الخلية وحافظت على قيم ثابتة تقريبا عندما استمرت منطقة انتشار الخلية في الزيادة.
يجب تحديد نطاقات مكدس Z لجميع قنوات الليزر بعناية للتغلب على الانجراف المحتمل لمجال الرؤية أثناء حركة المرحلة في التصوير على المدى الطويل. تتيح هذه التقنية الجديدة التصوير التلقائي وغير الغازي على المدى الطويل ومتعدد المواضع ، ويمكن أن تساعد في توضيح آلية البيولوجيا الجزيئية التي تتطلب التتبع الزمني والمكاني للخلايا والعضيات.
