שיטה זו תסייע להמחיש מנגנונים מולקולריים של תופעה ביולוגית רבת פנים. כגון מכנוביולוגיה, אלקטרופיזיולוגיה אופטית והדמיה סופר-רזולוציית DNA/RNA באמצעות טכניקות הדמיה אוטומטיות של תאים חיים. פרוטוקול זה מאפשר רכישה אוטומטית, רב-תכליתית, תפוקה גבוהה, תיקון עצמי ורכישת תמונה לטווח ארוך.
הוא תואם לרוב הפלטפורמות המיקרוסקופיות הפלואורסצנטיות, כגון NYCOM. כל מי שמנסה טכניקה זו בפעם הראשונה צריך להבין את הפונקציה של כל צעד, במקום רק לעקוב אחר הפרוטוקול בקפדנות, כדי להבטיח ניסוי מוצלח. התחל על ידי הצבת תא הסביבה על הבמה הממונעת של המיקרוסקופ ההפוך.
הגדר את קצב זרימת CO2 ל 160 מיליליטר לדקה ולהתאים את הטמפרטורה של התא. לאחר מכן להוסיף 40 מיליליטר של מים מטוהרים לתוך האמבטיה של התא. מוציאים את צלחת הפטרי עם תחתית הזכוכית עם תאים מהאינקובטור ומניחים אותה בתא הסביבה.
הפעל את בקר הקונפוקלי ואת המיקרוסקופ ההפוך. החלף את נתיב האור ימינה. שים לב לתאים המצורפים באמצעות Micro Manager.
אם חוברו מספיק תאים לג'ל, העבירו את צלחת הפטרי בחזרה לאינקובטור. אם לא, להמשיך את הדגירה התא במשך 30 דקות נוספות עבור B2B, ו 60 דקות עבור סרטן ריאות או תאי PC-9. חותכים 2 חתיכות קטנות של סרט הדבקה ומדביקים אותם על התא סביב החור העגול.
לאחר מכן להחיל דבק קטן על האזור של הסרט כי צלחת פטרי יכסה. תוציא את צלחת הפטרי מהאינקובטור. מניחים באיטיות את צלחת הפטרי בחדר ומניחים לתחתית המנה ליצור קשר עם הדבק.
לחץ על המכסה של צלחת פטרי במשך 1 דקה כדי לאפשר לדבק ליצור מגע מלא עם צלחת פטרי ולהתמצק. דוחפים בעדינות את צלחת הפטרי אופקית כדי להבטיח שהדבק התגבש וצלחת הפטרי לא זזה. ואז לסגור את המכסה של התא.
פתח את IntelliJ והגדר פרמטר T1 בשורה 93 של elements_script.java הקובץ. ודא שערך זה גדול יותר מזמן הריצה של המאקרו והרכיבים המשמשים להדמיה קונפוקלית של שדה ראייה אחד. לחץ על לחצן הפעל כדי להתחיל את פרויקט AMFIP IntelliJ.
לחץ על לחצן Live ו-multi-deacquisation בממשק הראשי של Micro Manager, ולאחר מכן החלף את נתיב האור של המיקרוסקופ ההפוך ימינה להדמיית שדה בהיר. עבור למטרה של 10 פעמים ופתח את נורית ה- LED בעוצמה המוגדרת על 5%לחץ על המטרה מיקרוסקופ נתיב האור וכפתור מנורת LED בחלונית הרכיבים TI2. התאימו את הג'ויסטיק XY ואת הידית של מישור Z כדי למצוא את המיקום הנכון ואת מישור המיקוד של הג'ל בצלחת פטרי.
השתמש במטרה 10 פעמים כדי למצוא את שדות הראייה המתאימים של תאים בודדים מרובים המחוברים לג'ל. סמן את תיבת XY של מיקומים מרובים בחלון הרכישה הרב-ממדית. לחץ על לחצן רשימת מיקומי העריכה וצפה בחלון רשימת מיקומי הבמה שמופיע.
שנה את המטרה ל-40 פעמים, הגדל את עוצמת נורית ה-LED ל-15%התאם מחדש את השלב הממונע של XY כדי לאתר את שדות הראייה ולתעד את הקואורדינטות על-ידי לחיצה על כפתור הסימון בחלון רשימת מיקומי הבמה. הקלט 6 עד 7 שדות תצוגה רצויים. לחץ על לחצן שמירה כחלון רשימת מיקומי הבמה כדי להקליט את הקואורדינטות והקלט T1 כמקטע מרווח הזמן של רכישת הדמיה ל- T1 במקטע נקודת הזמן בחלון הרכישה הרב-ממדית.
פתח רכיבים, שנה את נתיב האור מימין להדמיה קונפוקלית וכבה את נורית ה- LED. לאחר מכן לחץ על כפתור הסר שילוב והפעל את ערוץ הלייזר FITC להדמיית YAP על ידי סימון תיבת FITC. לאחר התאמת מהירות הסריקה למסגרת אחת לכל 2 שניות, סובב את הידית של מישור Z כדי למצוא את מיקום ה- Z של התאים המצורפים במהירות.
הקלט את הגבולות התחתונים והעליונים עבור מחסנית Z. לחץ על מאקרו ברצועת הכלים העליונה, בחר עורך מאקרו תחת התפריט הנפתח מאקרו והזן את הגבולות התחתונים והעליון עבור מחסנית Z לקובץ מאקרו. הפעל את ערוץ הלייזר DAPI להדמיית חרוזים על-ידי סימון תיבת DAPI כדי למצוא ולתעד את מיקום Z הממוקד של חרוזים.
עבור אל עורך המאקרו והזן את הערכים המוקלטים בקובץ המאקרו. כדי להגדיר את המשימה של הזזת השלב הממונע באמצעות AMFIP, עבור אל Micro Manager, לחץ על אוטומציה של תוספים כדי לפתוח את ממשק המשתמש הגרפי של AMFIP. לאחר מכן לחץ על הוסף נקודה או הסר לחצני נקודה כדי להשיג את המספר המדויק של שדות תצוגה שנבחרו.
הזן את הקואורדינטות המוקלטות של שדות תצוגה ללוח הקואורדינטות. הגדר את זמן הניסוי הכולל בשדה הטקסט הכולל של זמן הניסוי. לחץ על לחצן תצורת הזמן הנוסף והגדר את מרווח הזמן T2 של העברת השלב הממונע לכל FOV.
הגדל את גודל החלון של רכיבים וגרור את ממשק המשתמש הגרפי של AMFIP לצד ימין של המסך כדי למנוע מה- GUI להפריע לפעולות האוטומטיות של הסמן ולאחר מכן לחץ על לחצן Enter. לאחר סיום המאקרו הראשון. לחץ על כפתור הרכישה בחלון הרכישה הרב-ממדי.
לאחר סיום ההדמיה לטווח ארוך, הפסק את משימת AMFIP על-ידי לחיצה על לחצן ההשהיה בחלון יישום ה- Plug-in של האוטומציה ועל לחצן העצירה בחלון הרכישה הרב-ממדי. פתח רכיבים והגדר הדמיית מחסנית Z על-ידי לחיצה על הלחצנים העליונים והתחתונים בחלון הרכישה של ND. החלף את נתיב האור ימינה ופתח את נורית ה- LED.
הסירו לאט ובזהירות את מכסי התא ואת צלחת הפטרי תוך ניטור נוף השדה הבהיר לכל סחיפה של שדה הראייה. השתמש פיפטה פלסטיק לקחת 0.5 מיליליטר של פתרון SDS. בזהירות להחזיק את פיפטה פלסטיק קצת מעל המדיום התרבותי בצלחת פטרי ולהוסיף 1 עד 2 טיפות של פתרון SDS למדיום התרבות.
לאחר שהתאים ותצוגת השדה הבהירה מתמוססים, סגור את נורית ה- LED, החלף את נתיב האור שמאלה, לחץ על לחצן הסר שילוב. הפעל את הדמיית מחסנית Z ושמור את מחסנית התמונה reference_N, כאשר N הוא מספר הרצף של כל שדה תצוגה. לחץ על לחצן XY מיקומים מרובים בחלון הרכישה הרב-ממדי.
לאחר מכן בחר את שדה הראייה הבא ולחץ על לחצן go-to כדי להעביר את השלב הממונע ל- FOV השני. חזור על שלב זה עבור כל שדה תצוגה. הלוקליזציה הגרעינית היא של חלבון הקשורים כן או YAP ב B2B ells גדל עם נוקשות מצע גוברת, ואילו תאי PC-9 הראו ריכוז YAP דומה בגרעין וציטופלזם על מצעים של נוקשות משתנה.
תא B2B הגדיל באופן מונוטוני את אזור ההתפשטות לאורך זמן, יחד עם ירידה ביחס הגרעיני לציטופלסמי של YAP, בעוד שתא PC-9 שמר על אזור התפשטות תאים, אוריינטציה ויחס גרעיני לציטופלזמי של YAP ללא שינוי יחסית לאורך כל תהליך ההתפשטות של 10 שעות. במהלך 10 שעות של ההתפשטות המוקדמת, תא B2B הייצוגי עיוות את משטח המצע ויישם את המתיחה של התא המתפתח בזמן על פני כל אזור התא. לעומת זאת, תא PC-9 המייצג פיתח רק תזוזה ומתיחה בשני הקצוות של גוף התא, ומתיחה שלו פחתה לאחר 7.5 שעות.
היחס הגרעיני לציטופלסמי של YAP ומתיחה דיפול של תאי B2B נראה לעקוב אחר שתי מגמות ברורות, דבר המצביע על כך שאולי היו שתי קבוצות של תאי B2B כי להתקיים יחד בניסוי. בקבוצה הראשונה, יחס הגרעין לציטופלסמי של YAP ומתיחה דיפול גדל יחד עם הגדלת אזור התפשטות התא והגיע למקסימום שלהם בערך 1, 000 מ"ר. בקבוצה השנייה, יחס הגרעין לציטופלסמיה של YAP ומתיחה דיפול גדל בקצב איטי יותר עם הגדלת אזור התפשטות התא ושמר על ערכים כמעט קבועים כאשר אזור התפשטות התא המשיך לגדול.
טווחי מחסנית Z עבור כל ערוצי הלייזר צריך להיקבע בזהירות כדי להתגבר על הסחף הפוטנציאלי של שדה הראייה במהלך תנועת הבמה בהדמיה לטווח ארוך. טכניקה חדשנית זו מאפשרת הדמיה אוטומטית, לא פולשנית לטווח ארוך ורב-שכבתי, ויכולה לסייע בהבהרת מנגנון ביולוגיה מולקולרית הדורש מעקב זמני ומרחבי אחר תאים ואברונים.
