이 방법은 다각적인 생물학적 현상의 분자 메커니즘을 설명하는 데 도움이 될 것입니다. 자동 라이브 세포 이미징 기술을 사용하여 기계생물학, 광학 전기 생리학 및 초해상도 DNA/RNA 단백질 이미징과 같은. 이 프로토콜을 사용하면 자동, 다기능, 고처리량, 자체 드리프트 수정 및 장기 이미지 수집을 가능하게 합니다.
NYCOM과 같은 대부분의 형광 현미경 플랫폼과 호환됩니다. 이 기술을 처음으로 시도하는 사람은 성공적인 실험을 보장하기 위해 프로토콜을 엄격하게 따르는 대신 각 단계의 기능을 이해해야합니다. 먼저 환경 챔버를 반전 된 현미경의 전동 단계에 배치하여 시작합니다.
CO2 유량은 분당 160 밀리리터로 설정하고 챔버의 온도를 조정합니다. 그런 다음 40 밀리리터의 정제수를 챔버의 욕조에 넣습니다. 인큐베이터의 셀이 있는 유리 바닥 페트리 접시를 꺼내 환경 챔버에 놓습니다.
공초점 컨트롤러와 반전 된 현미경을 켭니다. 라이트 경로를 오른쪽으로 전환합니다. 마이크로 관리자를 사용하여 부착되는 셀을 관찰합니다.
충분한 세포가 젤에 부착된 경우 페트리 접시를 인큐베이터로 다시 옮기게 합니다. 그렇지 않은 경우, B2B에 대한 또 다른 30 분 동안 세포 배양을 계속하고 폐암 또는 PC-9 세포를 위한 60 분. 접착제 테이프 2개를 자르고 원형 구멍 주변의 챔버에 붙입니다.
그런 다음 페트리 접시가 덮을 테이프 영역에 약간의 접착제 접착제를 적용합니다. 인큐베이터에서 페트리 요리를 꺼내라. 페트리 접시를 천천히 챔버에 넣고 접시 의 바닥이 접착제와 접촉하게하십시오.
페트리 접시 뚜껑을 1분간 눌러 접착제가 페트리 접시와 완전히 접촉하고 굳어지도록 합니다. 페트리 접시를 부드럽게 밀어 접착제가 고화되고 페트리 접시가 움직이지 않도록 합니다. 그런 다음 챔버의 뚜껑을 닫습니다.
IntelliJ를 열고 파일 elements_script.java 93줄에 매개 변수 T1을 설정합니다. 이 값이 매크로의 실행 시간 및 한 시야의 공초점 이미징에 사용되는 요소보다 큰지 확인합니다. AMFIP IntelliJ 프로젝트를 시작하려면 실행 버튼을 클릭합니다.
마이크로 매니저의 메인 인터페이스에서 라이브 및 다중 분해 버튼을 클릭한 다음 밝은 필드 이미징을 위해 반전된 현미경의 광 경로를 오른쪽으로 전환합니다. 10배 의 목표로 전환하고 TI2 패널 요소의 라이트 패스 현미경 목표및 LED 램프 버튼을 5%로 설정하여 LED 라이트를 엽니다. XY 조이스틱과 Z 평면의 노브를 조정하여 페트리 접시에 젤의 올바른 위치와 초점 평면을 찾습니다.
젤에 부착된 다중 단일 세포의 적절한 시야를 찾기 위해 10배 의 목표를 사용합니다. 다차원 획득 창에서 여러 위치 XY 상자를 확인합니다. 편집 위치 목록 버튼을 클릭하고 팝업 스테이지 위치 목록 창을 관찰합니다.
목표를 40배로 변경하고, LED 라이트의 강도를 XY 전동 스테이지의 15%로 늘려 시야 필드를 찾고 스테이지 위치 목록 창의 마크 버튼을 클릭하여 좌표를 기록합니다. 원하는 보기 필드 6~7장을 기록합니다. 스테이지 위치 목록 창의 단추로 저장을 클릭하여 다차원 획득 창의 시간 포인트 섹션에서 T1에 대한 이미징 수집의 시간 간격 섹션으로 좌표 및 입력 T1을 기록합니다.
요소를 열고, 공초점 이미징을 위해 오른쪽으로 라이트 경로를 변경하고 LED 조명을 끕니다. 그런 다음 제거 연동 버튼을 클릭하고 FITC 상자를 확인하여 YAP 이미징을 위한 FITC 레이저 채널을 켭니다. 2초당 스캐닝 속도를 1프레임으로 조정한 후 Z 평면의 노브를 회전하여 연결된 셀의 Z 위치를 빠르게 찾습니다.
Z 스택의 하부 및 상한을 기록합니다. 상단 리본의 매크로를 클릭하고 매크로 드롭다운 메뉴에서 매크로 편집기를 선택하고 Z 스택의 하부 및 상한을 매크로 파일에 입력합니다. DAPI 상자를 확인하여 비즈 이미징을 위한 DAPI 레이저 채널을 켜서 구슬의 집중된 Z 위치를 찾아 기록합니다.
매크로 편집기로 이동하여 기록된 값을 매크로 파일에 입력합니다. AMFIP를 사용하여 전동 스테이지를 이동하는 작업을 설정하려면 마이크로 관리자로 이동하여 플러그인 자동화를 클릭하여 AMFIP의 그래픽 사용자 인터페이스를 엽니다. 그런 다음 포인트 추가 또는 포인트 버튼을 제거하여 선택한 정확한 보기 필드 수를 획득합니다.
뷰 필드의 기록된 좌표를 좌표 패널에 입력합니다. 총 실험 시간 텍스트 필드에서 총 실험 시간을 정의합니다. 추가 시간 구성 버튼을 클릭하고 전동 스테이지를 각 FOV로 이동하는 시간 간격 T2를 정의합니다.
요소의 창 크기를 최대화하고 AMFIP의 GUI를 화면 오른쪽으로 드래그하여 GUI가 커서의 자동 작동을 방해하는 것을 방지한 다음 enter 버튼을 클릭합니다. 첫 번째 매크로가 끝나면. 다차원 획득 창에서 획득 버튼을 클릭합니다.
장기 이미징을 마친 후 자동화 플러그인 창의 일시 중지 버튼을 클릭하고 다차원 획득 창의 정지 버튼을 클릭하여 AMFIP 작업을 중지합니다. 요소를 열고 ND 획득 창의 위쪽 및 아래쪽 단추를 클릭하여 Z 스택 이미징을 설정합니다. 라이트 경로를 오른쪽으로 전환하고 LED 표시등을 엽니다.
시야의 드리프트에 대한 밝은 필드 뷰를 모니터링하면서 챔버와 페트리 접시의 뚜껑을 천천히 조심스럽게 제거합니다. 플라스틱 파이펫을 사용하여 SDS 용액의 0.5 밀리리터를 차지합니다. 페트리 접시의 배양 매체 보다 플라스틱 파이펫을 조심스럽게 잡고 SDS 용액의 1~2방울을 배양 매체에 넣습니다.
셀과 밝은 필드 뷰가 용해되면 LED 라이트를 닫고 라이트 경로를 왼쪽으로 전환하고 제거 연동 버튼을 클릭합니다. Z 스택 이미징을 실행하고 이미지 스택을 각 시야의 시퀀스 수인 reference_N 저장합니다. 다차원 획득 창에서 여러 위치 XY 버튼을 클릭합니다.
그런 다음 다음 뷰 필드를 선택하고 이동 단추를 클릭하여 전동 스테이지를 두 번째 FOV로 이동합니다. 각 시야에 대해 이 단계를 반복합니다. 핵 국소화는 B2B 엘스의 예 관련 단백질 또는 YAP가 기질 강성이 증가함에 따라 증가한 반면, PC-9 세포는 다양한 강성의 기판에 핵및 세포질에서 유사한 YAP 농도를 보였다.
B2B 세포는 시간이 지남에 따라 확산 영역을 모노톤으로 증가시켰으며, YAP 핵대 세포질 비의 감소와 함께 PC-9 세포는 10시간 동안 세포 확산 영역, 방향 및 YAP 핵대 세포질 비율을 비교적 변하지 않는 세포 확산 영역, 방향 및 YAP 핵을 유지하였다. 초기 확산의 10 시간 기간 동안, 대표 B2B 세포는 기판 표면을 구성적으로 변형하고 전체 세포 영역에 걸쳐 세포 견인을 진화 시간을 적용. 대조적으로, 대표적인 PC-9 셀은 세포 체의 2 단에서 변위와 견인만 을 개발했으며, 그 견인력은 7.5시간 후에 감소했습니다.
B2B 세포의 YAP 핵 대 세포질 비 및 이폴 견인은 두 가지 뚜렷한 추세를 따르는 것으로 나타났으며, 이는 실험에서 공존하는 B2B 세포의 두 그룹이 있었을 수 있음을 시사합니다. 첫 번째 그룹에서는, YAP 핵대 세포질비 및 이폴 견인은 세포 확산 면적의 확대와 함께 증가하고 약 1, 000 평방 마이크로미터에서 그들의 최대군에 도달했습니다. 두 번째 그룹에서는, YAP 핵대 세포질비 및 이폴 견인은 세포 확산 영역의 확대와 함께 느린 속도로 증가하고 세포 확산 영역이 계속 증가할 때 거의 일정한 값을 유지했다.
모든 레이저 채널에 대한 Z 스택 범위는 장기 이미징에서 단계 운동 중 시야의 잠재적 인 드리프트를 극복하기 위해 신중하게 결정되어야합니다. 이 새로운 기술은 자동, 비침습적 장기 및 다중 위치 이미징을 가능하게하고, 세포와 세포기관의 시간적 및 공간 추적을 필요로 하는 분자 생물학 기계장치를 해명하는 것을 도울 수 있습니다.
