Questo metodo aiuterà a illustrare i meccanismi molecolari di un fenomeno biologico sfaccettato. Come la meccanobiologia, l'elettrofisiologia ottica e l'imaging proteico DNA / RNA a super-risoluzione utilizzando tecniche automatiche di imaging di cellule vive. Questo protocollo consente l'acquisizione automatica, multifunzionale, ad alto throughput, auto-drift correcting e a lungo termine.
È compatibile con la maggior parte delle piattaforme microscopiche fluorescenti, come NYCOM. Chiunque provi questa tecnica per la prima volta dovrebbe capire la funzione di ogni passaggio, invece di seguire solo rigorosamente il protocollo, per garantire un esperimento di successo. Iniziare posizionando la camera ambientale sullo stadio motorizzato del microscopio invertito.
Impostare la portata di CO2 a 160 millilitri al minuto e regolare la temperatura della camera. Quindi aggiungere 40 millilitri di acqua purificata nel bagno della camera. Estrarre la capsula di Petri con fondo di vetro con le cellule dell'incubatrice e posizionarla nella camera dell'ambiente.
Accendere il controller confocale e il microscopio invertito. Cambiare il percorso della luce a destra. Osservare le celle che si attaccano utilizzando Micro Manager.
Se al gel sono state attaccate cellule sufficienti, trasferire la capsula di Petri all'incubatrice. In caso contrario, continuare l'incubazione cellulare per altri 30 minuti per B2B e 60 minuti per il cancro del polmone o le cellule PC-9. Tagliare 2 piccoli pezzi di nastro adesivo e incollarli sulla camera attorno al foro circolare.
Quindi applicare un po 'di colla adesiva sull'area del nastro che la capsula di Petri coprirà. Estrarre la capsula di Petri dall'incubatrice. Posizionare lentamente la capsula di Petri nella camera e lasciare che il fondo del piatto entri in contatto con la colla.
Premere il coperchio della capsula di Petri per 1 minuto per consentire alla colla di entrare in pieno contatto con la capsula di Petri e solidificare. Spingere delicatamente la capsula di Petri orizzontalmente per assicurarsi che la colla si sia solidificata e che la piastra di Petri non si muova. Quindi chiudere il coperchio della camera.
Aprire IntelliJ e impostare un parametro T1 nella riga 93 del file elements_script.java. Assicurarsi che questo valore sia maggiore del tempo di esecuzione della macro e degli elementi utilizzati per l'imaging confocale di un campo visivo. Fare clic sul pulsante Esegui per avviare il progetto AMFIP IntelliJ.
Fare clic sul pulsante live e multi-deacquisition sull'interfaccia principale di Micro Manager, quindi spostare il percorso della luce del microscopio invertito a destra per l'imaging in campo luminoso. Passare all'obiettivo 10 volte e aprire la luce LED con l'intensità impostata al 5% Fare clic sull'obiettivo del microscopio del percorso luminoso e sul pulsante della lampada a LED nel pannello ti2 degli elementi. Regolare il joystick XY e la manopola del piano Z per trovare la posizione corretta e il piano di messa a fuoco del gel sulla capsula di Petri.
Utilizzare l'obiettivo 10 volte per trovare i campi visivi appropriati di più singole cellule attaccate al gel. Selezionare la casella XY a più posizioni nella finestra di acquisizione multidimensionale. Fare clic sul pulsante Modifica elenco posizioni e osservare la finestra dell'elenco delle posizioni dello stage che viene visualizzata.
Modificare l'obiettivo a 40 volte, aumentare l'intensità della luce LED al 15% Riadattare lo stadio motorizzato XY per individuare i campi visivi e registrare le coordinate facendo clic sul pulsante di marcatura nella finestra dell'elenco delle posizioni dello stage. Registra da 6 a 7 campi visivi desiderati. Fare clic sul pulsante Salva con nome nella finestra dell'elenco delle posizioni dello stage per registrare le coordinate e immettere T1 come sezione dell'intervallo di tempo dell'acquisizione dell'immagine su T1 nella sezione del punto temporale nella finestra di acquisizione multidimensionale.
Aprite gli elementi, cambiate il percorso della luce verso destra per l'imaging confocale e spegnete la luce a LED. Quindi fare clic sul pulsante rimuovi interblocco e attivare il canale laser FITC per l'imaging YAP selezionando la casella FITC. Dopo aver regolato la velocità di scansione a 1 fotogramma per 2 secondi, ruotare la manopola del piano Z per trovare rapidamente la posizione Z delle celle collegate.
Registrare i limiti inferiore e superiore per lo stack Z. Fare clic sulla macro sulla barra multifunzione in alto, selezionare l'editor macro nel menu a discesa macro e immettere i limiti inferiore e superiore per lo stack Z in un file macro. Attivare il canale laser DAPI per l'imaging delle perline selezionando la casella DAPI per trovare e registrare la posizione Z focalizzata delle perline.
Vai all'editor di macro e inserisci i valori registrati nel file macro. Per impostare il compito di spostare lo stadio motorizzato utilizzando AMFIP, vai su Micro Manager, fai clic su automazione plug-in per aprire l'interfaccia utente grafica di AMFIP. Quindi fare clic sui pulsanti Aggiungi punto o Rimuovi punto per acquisire il numero esatto di campi visivi selezionati.
Inserite le coordinate registrate dei campi visivi nel pannello delle coordinate. Definire il tempo totale dell'esperimento nel campo di testo Tempo totale dell'esperimento. Fare clic sul pulsante di configurazione del tempo aggiuntivo e definire l'intervallo di tempo T2 per spostare lo stadio motorizzato su ciascun FOV.
Ingrandisci le dimensioni della finestra degli elementi e trascina la GUI di AMFIP sul lato destro dello schermo per evitare che la GUI disturbi le operazioni automatiche del cursore e quindi fai clic sul pulsante Invio. Al termine della prima macro. fare clic sul pulsante Acquisisci nella finestra di acquisizione multidimensionale.
Dopo aver completato l'imaging a lungo termine, interrompere l'attività AMFIP facendo clic sul pulsante di pausa nella finestra del plug-in di automazione e sul pulsante di arresto nella finestra di acquisizione multidimensionale. Apri gli elementi e imposta l'imaging dello stack Z facendo clic sui pulsanti superiore e inferiore nella finestra di acquisizione ND. Cambiare il percorso della luce a destra e aprire la luce a LED.
Rimuovere lentamente e con attenzione i coperchi della camera e della capsula di Petri mentre si monitora la vista del campo luminoso per qualsiasi deriva del campo visivo. Utilizzare una pipetta di plastica per assorbire 0,5 millilitri di soluzione SDS. Tenere con attenzione la pipetta di plastica un po 'sopra il terreno di coltura nella capsula di Petri e aggiungere da 1 a 2 goccioline della soluzione SDS nel terreno di coltura.
Una volta dissolte le celle e la vista del campo luminoso, chiudere la luce a LED, cambiare il percorso della luce a sinistra, fare clic sul pulsante rimuovi interblocco. Eseguire l'imaging dello stack Z e salvare lo stack di immagini come reference_N, dove N è il numero di sequenza di ciascun campo visivo. Fare clic sul pulsante XY a più posizioni nella finestra di acquisizione multidimensionale.
Quindi selezionare il campo visivo successivo e fare clic sul pulsante go-to per spostare lo stadio motorizzato sul secondo FOV. Ripetere questo passaggio per ogni campo visivo. La localizzazione nucleare è di proteina associata a yes o YAP in B2B ells aumentata con l'aumentare della rigidità del substrato, mentre le cellule PC-9 hanno mostrato una concentrazione di YAP simile nel nucleo e nel citoplasma su substrati di rigidità variabile.
La cellula B2B ha aumentato monotonamente l'area di diffusione nel tempo, insieme a una diminuzione del rapporto nucleare / citoplasmatico YAP, mentre la cellula PC-9 ha mantenuto un'area di diffusione cellulare relativamente invariata, orientamento e rapporto nucleare YAP / citoplasmatico durante il processo di diffusione di 10 ore. Durante la durata di 10 ore della diffusione precoce, la cellula B2B rappresentativa ha deformato costitutivamente la superficie del substrato e ha applicato la trazione cellulare in evoluzione temporale su tutta l'area cellulare. Al contrario, la cellula PC-9 rappresentativa ha sviluppato solo spostamento e trazione alle 2 estremità del corpo cellulare e la sua trazione è diminuita dopo 7,5 ore.
Il rapporto nucleare/citoplasmatico YAP e la trazione di dipolo delle cellule B2B sembravano seguire due tendenze distinte, suggerendo che potrebbero esserci stati due gruppi di cellule B2B che coesistevano nell'esperimento. Nel primo gruppo, il rapporto nucleare/citoplasmatico YAP e la trazione del dipolo sono aumentati insieme all'allargamento dell'area di diffusione cellulare e hanno raggiunto i loro massimi a circa 1.000 micrometri quadrati. Nel secondo gruppo, il rapporto nucleare/citoplasmatico YAP e la trazione del dipolo sono aumentati a un ritmo più lento con l'allargamento dell'area di diffusione cellulare e hanno mantenuto valori quasi costanti quando l'area di diffusione cellulare ha continuato ad aumentare.
Le gamme dello stack Z per tutti i canali laser devono essere determinate attentamente per superare la potenziale deriva del campo visivo durante il movimento del palcoscenico nell'imaging a lungo termine. Questa nuova tecnica consente l'imaging automatico, non invasivo a lungo termine e multiposizione e può aiutare a chiarire il meccanismo di biologia molecolare che richiede il monitoraggio temporale e spaziale di cellule e organelli.
