この方法は、多面的な生命現象の分子メカニズムを説明するのに役立ちます。メカノバイオロジー、光電気生理学、自動生細胞イメージング技術を用いた超解像DNA/RNAタンパク質イメージングなど。このプロトコルにより、自動、多機能、高スループット、自己ドリフト補正、および長期的な画像取得が可能になります。
NYCOMなどのほとんどの蛍光顕微鏡プラットフォームと互換性があります。この手法を初めて試す人は、プロトコルに厳密に従うだけでなく、各ステップの機能を理解して、実験を成功させる必要があります。まず、環境チャンバーを倒立顕微鏡の電動ステージに配置します。
CO2流量を毎分160ミリリットルに設定し、チャンバーの温度を調整します。その後、40ミリリットルの精製水をチャンバーの浴槽に加える。インキュベーターから細胞を入れたガラス底のペトリ皿を取り出し、それを環境チャンバーに入れます。
共焦点コントローラーと倒立顕微鏡の電源を入れます。ライトパスを右に切り替えます。マイクロマネージャを使用して付着しているセルを観察します。
十分な細胞がゲルに付着している場合は、シャーレをインキュベーターに戻します。そうでない場合は、B2Bについてはさらに30分間、肺癌またはPC-9細胞については60分間、細胞インキュベーションを継続する。粘着テープの2つの小さな部分を切断し、円形の穴の周りのチャンバーに貼り付けます。
次に、ペトリ皿が覆うテープの領域に少し接着剤を塗ります。インキュベーターからペトリ皿を取り出す。ゆっくりとペトリ皿をチャンバーに入れ、皿の底を接着剤と接触させます。
ペトリ皿の蓋を1分間押して、接着剤がペトリ皿と完全に接触して固まるようにします。ペトリ皿を水平に静かに押して、接着剤が固まり、ペトリ皿が動かないようにします。その後、チャンバーの蓋を閉めます。
IntelliJ を開き、ファイル elements_script.java の 93 行目にパラメーター T1 を設定します。この値が、1 つの視野の共焦点イメージングに使用されるマクロおよびエレメントの実行時間より大きいことを確認します。[実行] ボタンをクリックして、AMFIP IntelliJ プロジェクトを開始します。
Micro Managerのメインインターフェイスにあるライブおよびマルチデアクイジションボタンをクリックし、倒立顕微鏡の光路を右に切り替えて明視野イメージングを行います。10倍の対物レンズに切り替え、強度を5%に設定したLEDライトを開きます 要素TI2パネルのライトパス顕微鏡対物レンズとLEDランプボタンをクリックします。XYジョイスティックとZ平面のノブを調整して、ペトリ皿上のゲルの正しい位置と焦点面を見つけます。
10回の目標を使用して、ゲルに結合した複数の単一細胞の適切な視野を見つけます。多次元取得ウィンドウの複数位置XYボックスにチェックを入れます。位置リストの編集ボタンをクリックし、ポップアップするステージ位置リストウィンドウを確認します。
目標を40倍に変更し、LEDライトの強度を15%に増やしますXY電動ステージを再調整して視野を見つけ、ステージ位置リストウィンドウのマークボタンをクリックして座標を記録します。6 から 7 個の目的の視野を記録します。ステージ位置一覧ウィンドウの「名前を付けて保存」ボタンをクリックすると、多次元取得ウィンドウのタイムポイントセクションのT1に撮影取得の時間間隔区間として座標を記録し、T1を入力します。
エレメントを開き、共焦点イメージングのために光路を右に変更し、LEDライトをオフにします。次に、インターロックの削除ボタンをクリックし、FITCボックスをチェックして、YAPイメージング用のFITCレーザーチャンネルをオンにします。走査速度を2秒あたり1フレームに調整した後、Z平面のつまみを回転させて、付着した細胞のZ位置をすばやく見つけます。
Z スタックの下限と上限を記録します。一番上のリボンのマクロをクリックし、マクロドロップダウンメニューの下にあるマクロエディタを選択し、Zスタックの下限と上限をマクロファイルに入力します。DAPIボックスをチェックしてビーズイメージング用のDAPIレーザーチャンネルをオンにし、ビーズの集束Z位置を見つけて記録します。
マクロエディタに移動し、記録された値をマクロファイルに入力します。AMFIPを使用して電動ステージを移動するタスクを設定するには、Micro Managerに移動し、プラグインの自動化をクリックしてAMFIPのグラフィカルユーザーインターフェイスを開きます。次に、ポイントの追加またはポイントの削除ボタンをクリックして、選択したビューフィールドの正確な数を取得します。
視野の記録された座標を座標パネルに入力します。[合計実験時間] テキスト フィールドで合計実験時間を定義します。追加時間設定ボタンをクリックし、電動ステージを各FOVに移動する時間間隔T2を定義します。
要素のウィンドウサイズを最大化し、AMFIPのGUIを画面の右側にドラッグして、GUIがカーソルの自動操作を妨げないようにしてから、Enterボタンをクリックします。最初のマクロが終了した後。多次元取得ウィンドウの集録ボタンをクリックします。
長期イメージングが終了したら、オートメーションプラグインウィンドウの一時停止ボタンと多次元集録ウィンドウの停止ボタンをクリックして、AMFIPタスクを停止します。要素を開き、ND集録ウィンドウの上部と下部のボタンをクリックしてZスタックイメージングを設定します。ライトパスを右に切り替えて、LEDライトを開きます。
チャンバーとペトリ皿の蓋をゆっくりと慎重に取り外しながら、視野のドリフトがないか明るいフィールドビューを監視します。プラスチック製のピペットを使用して、0.5ミリリットルのSDS溶液を摂取します。プラスチックピペットをシャーレ内の培養液の少し上に慎重に保持し、SDS溶液の1〜2滴を培養液に加える。
セルと明るい視野が溶解したら、LEDライトを閉じ、ライトパスを左に切り替えて、インターロックの削除ボタンをクリックします。Z スタック イメージングを実行し、イメージ スタックをreference_Nとして保存します (N は各視野のシーケンス番号)。多次元取得ウィンドウの複数位置XYボタンをクリックします。
次に、次の視野を選択し、移動ボタンをクリックして電動ステージを2番目のFOVに移動します。視野ごとにこの手順を繰り返します。核局在化は、基質剛性の増加とともに増加したB2Bエルス中のyes関連タンパク質またはYAPのものであり、一方、PC-9細胞は、様々な剛性の基質上の核および細胞質において同様のYAP濃度を示した。
B2B細胞は、YAP核対細胞質比の減少とともに、時間の経過とともに拡散面積を単調に増加させたが、PC-9細胞は、10時間の拡散プロセスを通して、比較的不変の細胞拡散面積、配向、およびYAP核対細胞質比を維持した。早期拡散の10時間の持続時間の間に、代表的なB2B細胞は、基質表面を恒常的に変形させ、細胞領域全体にわたって細胞牽引を進化させる時間を適用した。対照的に、代表的なPC-9細胞は、細胞体の2つの端で変位および牽引力のみを発達させ、その牽引力は7.5時間後に減少した。
B2B細胞のYAP核対細胞質比および双極子牽引力は、2つの異なる傾向に従っているように見え、実験において共存したB2B細胞の2つのグループがあった可能性を示唆した。第1群では、YAP核対細胞質比および双極子牽引力は、細胞拡散面積の拡大とともに増加し、約1,000平方マイクロメートルでその最大値に達した。第2群では、YAP核対細胞質比および双極子牽引力は、細胞拡散面積の拡大とともにより遅い速度で増加し、細胞拡散面積が増加し続けたときにほぼ一定の値を維持した。
すべてのレーザーチャンネルのZスタック範囲は、長期イメージングにおけるステージ移動中の視野の潜在的なドリフトを克服するために慎重に決定する必要があります。この新規技術は、自動的かつ非侵襲的な長期およびマルチポジションイメージングを可能にし、細胞および細胞小器官の時間的および空間的追跡を必要とする分子生物学メカニズムの解明に役立つ可能性がある。
